本文關(guān)鍵詞： 胎盤 造血干/祖細(xì)胞 小鼠 胎盤 造血干/祖細(xì)胞 CD34 CD117 Sca-1 小鼠 胎盤 造血干/祖細(xì)胞 體外培養(yǎng) 小鼠　出處：《山東大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 血細(xì)胞的發(fā)生指的是由造血組織中的干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)經(jīng)增殖、分化直至成熟而形成各種血細(xì)胞的過程。所謂造血干細(xì)胞,是指存在于造血組織內(nèi)的一類能分化發(fā)育成各種血細(xì)胞的原始細(xì)胞�，F(xiàn)在一般認(rèn)為,在造血組織中存在一類能生成各種血細(xì)胞的最原始的細(xì)胞,稱之為全能造血干細(xì)胞(totipotential hematopoietic stem cell,THSC)。THSC在一定的造血微環(huán)境和某些因素的誘導(dǎo)下可增殖分化為多能淋巴干細(xì)胞(pludpotential lymphoid stem cell)和多能髓性造血干細(xì)胞(pluripotential myeloid stem cell,PMSC或CFU-S)。前者可進(jìn)一步分化、發(fā)育成功能性的淋巴細(xì)胞,后者可發(fā)育成粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞系、紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系等造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell,HPC),并進(jìn)一步發(fā)育為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等。因而,從造血細(xì)胞發(fā)生的角度可把造血細(xì)胞簡要分為三大部分,即造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和可辨認(rèn)的前體細(xì)胞(recognized precursor)。造血的過程就是造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞增殖分化形成血細(xì)胞的動態(tài)平衡過程,但不包括成熟細(xì)胞在體內(nèi)的儲存、釋放以及分配的過程。造血活動以造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞的活動為主。 在胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育過程中,首先由中胚層的間充質(zhì)組織分化為血液成血管細(xì)胞(hemangioblast),進(jìn)而形成HSC和成血管細(xì)胞(angioblast)。HSC首先發(fā)生的部位見于胚外卵黃囊血島和胚內(nèi)主動脈旁臟壁層/主動脈-性腺-中腎區(qū)(paraaortic splanchnopleure/aortagonad mesonephros,PAS/AGM)。隨著胚體內(nèi)外血循環(huán)的建立,HSC被播散在肝臟和脾臟,最終主要定居在骨髓,維持機(jī)體終身造血。 胚胎造血發(fā)育的研究迄今已有百余年歷史,在哺乳動物的胚胎中,卵黃囊,肝臟,胸腺,脾臟和骨髓都已經(jīng)被看作是具有造血功能的器官。近年來,有些研究認(rèn)為,胎盤也是一個造血器官,在胚胎期發(fā)揮著重要作用。但是目前就胎盤是否具有造血功能仍有激烈爭論。本實驗應(yīng)用多種實驗方法,檢測了胎盤的造血功能,力圖進(jìn)一步明確胎盤是否存在造血功能和胎盤造血的生物學(xué)特點。 第一部分小鼠胎盤組織中單個核細(xì)胞的分離、鑒定和胎盤中固有造血干/祖細(xì)胞(HS/PCs)的確認(rèn) 【研究目的】 從小鼠胎盤中去除胎盤中所含有的胎兒血和母體血,分離和檢測胎盤組織中固有的HS/PCs,探討小鼠胎盤是否具有造血功能。 【研究方法】 1、取孕12.5天小鼠,0.2ml水合氯醛腹腔注射麻醉,無菌條件下取出孕子宮,剝離子宮,完整取出胎鼠及其胎盤。在體視鏡下觀察,通過血流方向辨別臍動脈和臍靜脈。將注射器(BD 29 G)針頭朝向胎盤方向插入臍動脈,緩慢的將沖洗液肝素生理鹽水(0.5mg/ml,290000IU/ml)注入臍動脈。邊注射邊觀察,直至臍靜脈中無血細(xì)胞回流,臍靜脈中的液體變澄清,于是拔出注射器,終止注射。將沖出的胎盤內(nèi)的胎兒血細(xì)胞收集,作為對照。然后將胎盤從母體蛻膜、臍血管及卵黃囊殘跡上剝離,徹底沖洗胎盤中的母體血,直至胎盤變成白色。 2、將沖洗后的胎盤作石蠟切片,蘇木素伊紅染色,觀察胎盤組織中是否殘留血細(xì)胞。 3、將沖洗后的胎盤充分剪碎,加入0.1%膠原酶Ⅳ在37℃下攪拌消化30min,終止消化,離心。然后再加入0.25%胰酶37℃孵育10min,終止消化,離心。加入1ml新鮮培養(yǎng)基(IMDM),做成細(xì)胞懸液,以備通過離心提取單個核細(xì)胞。 4、將三種密度的Percoll梯度液(1.10g/ml,1.080g/ml,1.055g/ml)用長針頭注射器按密度從高到低逐層輕輕放置到10ml離心管中。將細(xì)胞懸液輕輕置于最上層,以2000 rpm離心25min。用吸管將上層和中間層分離液之間的細(xì)胞帶小心取出,再加入1ml新鮮培養(yǎng)液IMDM,制成單個核細(xì)胞懸液。 5、制作細(xì)胞涂片,Giemsa染色。光學(xué)顯微鏡觀察是否為單個核細(xì)胞。 6、運(yùn)用脾結(jié)節(jié)形成技術(shù)檢測從胎盤組織中提取的單個核細(xì)胞是否為造血干細(xì)胞。 【結(jié)果】 1、沖洗后胎盤胎兒血管內(nèi)均見不到胎兒血細(xì)胞,胎盤中的胎兒血已經(jīng)被清除干凈。 2、采用組合酶消化法制備胎盤細(xì)胞懸液,Percoll密度梯度離心法分離的細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞涂片Giemsa染色光鏡觀察,確認(rèn)為單個核細(xì)胞,直徑在7～10μm,形似小淋巴細(xì)胞。 3、將分離后得到的單個核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入致死劑量照射的小鼠,觀察到受體鼠脾臟上出現(xiàn)大量脾結(jié)節(jié)。脾臟組織切片蘇木素伊紅染色光鏡觀察確認(rèn)為脾結(jié)節(jié)形成單位,即造血集落。 【結(jié)論】 采用胎盤沖洗的方法可以將胎盤中的胎兒血細(xì)胞和母體血細(xì)胞清除干凈,Percoll密度梯度離心法可有效分離胎盤中單個核細(xì)胞。脾結(jié)節(jié)實驗顯示,這些單個核細(xì)胞具有形成脾結(jié)節(jié)的能力,符合HS/PCs的特征,是胎盤中固有的HS/PCs。 第二部分運(yùn)用HS/PCs的表面標(biāo)志確認(rèn)胎盤固有HS/PCs的存在及其數(shù)量和分布 【研究目的】 運(yùn)用免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測胎盤組織中單個核細(xì)胞的表面標(biāo)志,以確認(rèn)胎盤固有HS/PCs的存在及其數(shù)量和分布,從而進(jìn)一步證明胎盤的造血功能。 【研究方法】 1、運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測胎盤組織中的單個核細(xì)胞是否表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34、CD117和Sca-1,以便進(jìn)一步確認(rèn)胎盤組織中存在固有的HS/PCs。 2、運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測來自胎盤組織中的CD34、CD117和Sca-1陽性細(xì)胞的相對數(shù)和絕對數(shù),以判斷胎盤固有造血細(xì)胞的分化狀況,并與來自胎盤胎兒血中的單個核細(xì)胞的相應(yīng)檢測結(jié)果比對。 3、胎盤冰凍切片,CD34、CD117和Sca-1免疫組化染色,以觀察胎盤固有HS/PCs在胎盤組織中的分布狀況。 【結(jié)果】 1、免疫熒光染色顯示胎盤組織中的單個核細(xì)胞表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34,CD117和Sca-1。CD34~+細(xì)胞百分率為20.1±5.3%,CD117~+細(xì)胞百分率為28.5±3.4%,Sca-1~+細(xì)胞百分率為35±8.6%。證明胎盤中的這些單個核細(xì)胞確實為HS/PCs。 2、流式細(xì)胞術(shù)顯示,胎盤HS/PCs表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34,CD117和Sca-1的三個細(xì)胞群所占的比例分別為20.2%,24.6%和26.2%。在來自胎盤胎兒血的單個核細(xì)胞中,這三個細(xì)胞群所占的比例分別為8.2%,6.3%和6.5%。胎盤的單個核細(xì)胞中三種陽性細(xì)胞的濃度均高于胎盤胎兒血的單個核細(xì)胞。胎盤的單個核細(xì)胞中,CD34~+、CD117~+、Sca-1~+陽性細(xì)胞的絕對數(shù)分別為1.4×10~4,1.8×10~4和1.8×10~4,在胎盤胎兒血單個核細(xì)胞中則分別為0.7×10~4,0.5×10~4和0.5×10~4。胎盤的單個核細(xì)胞中三種陽性細(xì)胞數(shù)均高于胎盤胎兒血。胎盤的單個核細(xì)胞中CD34~+/Sca-1~+細(xì)胞所占的比例為15.3%,要比胎盤胎兒血中的比例高,后者為5.1%。 3、在E12.5的鼠胚胎盤中,胎盤迷路內(nèi)可見CD34~+細(xì)胞、CD117~+細(xì)胞和Sca-1~+細(xì)胞,在絨毛膜板也可見CD117~+細(xì)胞,Sca-1表達(dá)量顯著高于CD34和CD117。 【結(jié)論】 運(yùn)用HS/PCs表面特異性抗原的免疫組化、免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù),進(jìn)一步證明了胎盤具有造血功能,胎盤組織中存在固有的HS/PCs,且具有一定的分布規(guī)律。 第三部分胎盤單個核細(xì)胞的體外培養(yǎng)和造血調(diào)控基因表達(dá)的檢測確認(rèn)胎盤的造血功能 【研究目的】 通過對胎盤組織中單個核細(xì)胞的體外培養(yǎng)、造血集落形成和造血調(diào)控基因表達(dá)的觀察和檢測,進(jìn)一步證明胎盤的造血功能。 【研究方法】 1、將胎盤單個核細(xì)胞接種在甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)14d后觀察是否形成造血集落,并確定集落的屬性,檢測高增殖潛能集落形成狀況。取自胎盤胎兒血液的單個核細(xì)胞作上述同樣檢測,作為陽性對比。 2、RT-PCR檢測胎盤組織中單個核細(xì)胞Scl、Runx1、Tel/Etv6、GATA-2的表達(dá)狀況。 【結(jié)果】 1、胎盤單個核細(xì)胞培養(yǎng)14天后,可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落形成。胎盤胎兒血單個核細(xì)胞培養(yǎng)14天后,也可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落生成,但前者的BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM集落數(shù)均高于后者,前者BFU-E的形態(tài)特點為多中心,高度血紅蛋白化;后者BFU-E則為弱血紅蛋白化。前者CFU-GM集落較致密,大小為中度或較大,有時集落巨大,好像是幾個集落融合而成;后者CFU-GM集落則較小。兩者的CFU-GEMM集落都很大,都可以用作為HPP-CFCs的來源。 2、來自胎盤組織和來自胎盤胎兒血細(xì)胞的HPP-CFCs培養(yǎng)60天后,均形成直徑超過0.5mm的集落。10~5個胎盤單個核細(xì)胞再植后可獲得35個CFU-GEMM集落,胎盤胎兒血單個核細(xì)胞再植后也可以獲得CFU-GEMM集落,但數(shù)量僅為胎盤細(xì)胞的2/3,而且胎盤胎兒血單個核細(xì)胞形成的集落要比胎盤單個核細(xì)胞形成的集落小。 3、造血調(diào)控相關(guān)基因Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2在胎盤組織的單個核細(xì)胞上均有表達(dá)。 【結(jié)論】 胎盤組織中的單個核細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可形成多種造血祖細(xì)胞克隆,并可檢測到HPP-CFCs(體外培養(yǎng)的最原始的多潛能造血前體細(xì)胞之一)的活性,說明胎盤中的單個核細(xì)胞是HS/PCs,并有多向分化潛能。造血調(diào)控相關(guān)基因Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2在胎盤組織的單個核細(xì)胞上均有表達(dá)這進(jìn)一步證明了小鼠胎盤具有造血功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R33;R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1518391