本文關(guān)鍵詞： 人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞 人外周血單個核細(xì)胞 前列腺素E2 免疫抑制 人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞 前列腺素E2 白介素1β 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 白介素17　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem cells, MSC)是一類具有自我更新(selfrenewal)和多向分化潛能(multi-lineage differentiation)的成體干細(xì)胞。它來源廣泛,具有支持造血和多向分化功能；隨著對MSC認(rèn)識的不斷加深,人們還發(fā)現(xiàn)MSC具有低免疫原性和較強的免疫調(diào)節(jié)功能。目前研究最多的主要是人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSC).人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)由于其較人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞更易于制備以及低風(fēng)險病毒感染,并且臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞易于體外培養(yǎng)及擴增等優(yōu)勢已經(jīng)成為人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞非常好的替代品。但是,人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)方面功能尚未有深入研究。 目的：研究人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)的作用及發(fā)揮作用的機制。方法：人外周血單個核細(xì)胞由不同的刺激劑刺激后與人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng),通過檢測人外周血單個核細(xì)胞的增殖及IFN-γ分泌情況觀察人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)；用transwell培育板培養(yǎng)來研究間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用是否需要細(xì)胞直接接觸；用各種抑制劑確定人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)的因子機制；另外,通過流式檢測人外周血單個核細(xì)胞Annexin-V的情況來觀察人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的情況及相關(guān)機制。 結(jié)果：人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效有效抑制人外周血單個核細(xì)胞刺激后的增殖及IFN-γ的分泌；Transwell系統(tǒng)共培養(yǎng)結(jié)果顯示此抑制效果不受細(xì)胞接觸的影響,既是這種抑制作用主要通過因子發(fā)揮免疫效應(yīng)；抑制劑試驗排除了TGF-β,IDO和NO的可能,并確定了前列腺素E2(PGE2)是人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)的介導(dǎo)因子；炎癥因子IFN-γ和IL-1β能顯著上調(diào)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞PGE2的分泌；人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞能保護人外周血單個核細(xì)胞刺激后的凋亡發(fā)生,并且此保護效應(yīng)也是通過分泌PGE2發(fā)揮的作用。 結(jié)論：人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)同樣能夠發(fā)揮很好的免疫調(diào)節(jié)作用,并且第一次發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞的免疫學(xué)效應(yīng)主要是通過PGE2的分泌實現(xiàn),這一機制對于將來人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 背景：一種最近受人關(guān)注的因子IL-17,作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的標(biāo)志炎癥因子,最初由一群新T細(xì)胞群‘Th17’產(chǎn)生。在最近幾年的研究中取得了許多相關(guān)成果,包括Thl7細(xì)胞趨導(dǎo)分化的分子機制的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。這些對于弄清Th17細(xì)胞在宿主防御和自身免疫中的作用有很大幫助。最近的研究證實由IL-17產(chǎn)生細(xì)胞激發(fā)的炎癥是許多人類自身免疫病動物自身免疫病模型的發(fā)展和致病的中心環(huán)節(jié)。并且激活的IL-23／IL-17軸對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病免疫炎癥非常重要。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,可以向中胚層來源組織分化并且從各種組織分離得到。MSCs已經(jīng)被認(rèn)為在免疫細(xì)胞上擁有非常廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,對許多效應(yīng)功能有調(diào)節(jié)作用。最近報道胎兒骨髓來源MSCs能夠促進正常供者來源的IL-17分泌細(xì)胞的擴增。而臍帶來源MSCs對于免疫細(xì)胞這一效應(yīng)尚不清楚。 目的：本文主要研究臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)對于來自于正常供者或者SLE患者T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)作用,特別是對于Th17細(xì)胞。這樣可以擴展我們對于MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的理解以及其作為細(xì)胞依賴治療免疫紊亂疾病的臨床運用潛力提供更多見解。 方法：我們將hPBMCs(來自于健康供者和SLE病人)或者CD4+T(來自于健康供者)細(xì)胞與hUC-MSCs培養(yǎng),并將這個培養(yǎng)體系稱為共培養(yǎng)細(xì)胞。hPBMCs細(xì)胞由絲裂原PHA刺激,而CD4+T細(xì)胞由ati-CD3/CD28 Dynabeads刺激。①我們用實時定量PCR,酶聯(lián)免疫吸附法對比建康供者或者SLE患者來源hPBMCs表達IL-17分泌的水平。并檢測加入另IL-6,PGE2和IL-1β中和試劑的IL-17表達改變。用酶聯(lián)免疫吸附法和流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞在與hUC-MSCs作用后IL-17分泌表達量的改變。③IFN-γ和TGF-β的表達用酶聯(lián)免疫吸附法檢測,而Thl細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例由流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測。④我們用酶聯(lián)免疫吸附法比較健康供者和SLE患者IL-23的分泌水平改變。 結(jié)果：正常供者來源CD4+T細(xì)胞與臍帶來源MSCs共培養(yǎng)比單純培養(yǎng)正常供者CD4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生高的IL-17分泌水平。相同的結(jié)果在正常供者PBMCs細(xì)胞中也得到證實。抑制試驗證實這個效應(yīng)可能部分是通過PGE2或者IL-1β介導(dǎo)產(chǎn)生的,并且IL-23不參與其中。接下來我們將hUC-MSCs與SLE患者來源PBMCs細(xì)胞共培養(yǎng),體外誘導(dǎo)IL-17的能力,hUC-MSCs能夠更促進SLE病人分泌,但是并不能影響IL-23的分泌。同時,hUC-MSCs降低了Thl細(xì)胞數(shù)量而增加Treg細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)論：綜上所述,我們的結(jié)果第一次報道了hUC-MSCs同時促進健康供者和SLE病人來源PBMCs產(chǎn)生IL-17。PGE2和IL-1β可能部分參與hUC-MSCs的這個促進作用。這個發(fā)現(xiàn)可能對于hUC-MSCs運用于SLE患者潛在致病作用提出觀點。考慮到血清中IL-17含量與SLE患者疾病活性相關(guān)性,臨床運用hUC-MSCs治療SLE可能需要更多仔細(xì)的研究。
[Abstract]:Background: mesenchymal stem cells (Mesenchymal Stem cells, MSC) is a kind of self-renewal and multilineage differentiation potential (selfrenewal) (multi-lineage differentiation) of adult stem cells. It has a wide range of sources, supporting hematopoiesis and differentiation function of MSC; with the deeper understanding, people also found that MSC has low immunity the original and strong immune function. At present, most research is mainly from human bone marrow mesenchymal stem cells (hBM-MSC). Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) due to its more human bone marrow derived mesenchymal stem cells more easy preparation and low risk of viral infection, and umbilical cord mesenchymal stem cells can be easily cultured in vitro and amplification and other advantages has become human bone marrow derived mesenchymal stem cells are very good alternatives. However, human umbilical cord derived mesenchymal stem cells in regulating immune function is No further study.
Objective: To study the human umbilical cord derived mesenchymal stem cells play the role of immunological effect and the role of the mechanism. Methods: human peripheral blood mononuclear cells by different stimuli after stimulation with human umbilical cord derived mesenchymal stem cells co culture, proliferation and IFN- gamma through detection of human peripheral blood mononuclear cells the observation of secretion of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells to study the immune regulation effect; cultured mesenchymal stem cells immune regulation whether the need for direct contact with Transwell cells cultivation plate; determining factor mechanism of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells play the immunological effect of various inhibitors; in addition, by flow cytometry human peripheral blood mononuclear cells Annexin-V to observe the human umbilical cord derived mesenchymal stem cells play the effect and related mechanism.
Results: human umbilical cord derived mesenchymal stem cells can secrete IFN- effectively inhibited the proliferation and gamma of human peripheral blood mononuclear cells after stimulation; Transwell co culture system showed that the inhibition effect is not affected by cell contact, this is mainly through the inhibition of immune factor effect; inhibitor trials excluded TGF- beta IDO, and NO, and to determine the prostaglandin E2 (PGE2) is the human umbilical cord derived mesenchymal stem cells play the immunological effect mediated factor; inflammatory cytokines IFN- and IL-1 beta gamma can increase secretion of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells PGE2; human umbilical cord derived mesenchymal stem cells to apoptosis the protection of human peripheral blood mononuclear cells after stimulation, and this protective effect is through the secretion of PGE2 play a role.
Conclusion: human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) can also play a good immune regulatory role, and for the first time found that the immunological effect of the cells is mainly through the secretion of PGE2, this mechanism provides a theoretical basis for future clinical application of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells.
Background: a recent concern factor IL-17, as a marker of the adaptive immune system inflammation, was first produced by a new T cell group 'Th17'. There has been much progress in research in recent years, including the standard molecular mechanism of Thl7 cell differentiation. These tend to lead to clear Th17 cells in host defense and immune function of great help. Recent studies have demonstrated that IL-17 produced by inflammatory cells stimulate the central link of many human autoimmune disease animal model of autoimmune disease development and disease. And the activation of IL-23 / IL-17 axis for systemic lupus erythematosus (SLE) disease is inflammation important. Mesenchymal stem cells are multipotent stem cells that can differentiate into tissues of mesodermal origin and isolated from various tissues by.MSCs has been very have on immune cells Extensive immunomodulatory effect has many regulatory effects on many effector functions. Recently, fetal bone marrow derived MSCs can promote the expansion of IL-17 secreting cells from normal donors. However, the effect of MSCs from umbilical cord on immune cells is not clear.
Objective: To study the umbilical cord derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) regulating effect for immune from healthy donors and patients with T SLE lymphocytes, especially for Th17 cells. This can be extended to understand our regulatory function for MSCs immune cells as well as its dependence on treatment of immune disorders provide the potential for clinical use more insights.
Methods: we will hPBMCs (from healthy donors and SLE patients) or CD4+T (from healthy donors) and hUC-MSCs cell culture, and the culture system of cells called.HPBMCs cells induced by mitogen stimulation of PHA co cultured CD4+T cells by ati-CD3/CD28 Dynabeads stimulation. We use real-time quantitative PCR, ELISA comparison of adsorption from healthy donor or SLE in patients with hPBMCs. The expression levels of IL-17 secretion and detection of addition of IL-6, changes in the expression of PGE2 and IL-1 beta IL-17 and neutralization reagent. CD4+T cells were detected by flow cytometry in the interaction of hUC-MSCs and the expression of IL-17 secretion changes by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression of IFN- gamma and TGF- beta was detected by ELISA, and the proportion of Thl cells and Treg cells by flow cytometry. We used enzyme-linked immunosorbent assay for IL-23 patients compared to healthy and SLE secretion level Change.
Results: normal donor derived CD4+T cells and human umbilical cord derived MSCs co culture than pure cultures of normal donor CD4+T cells can produce high levels of IL-17 secretion. The same results have also been confirmed in normal donor PBMCs cells. Inhibition test confirmed that the effect may be produced by PGE2 or IL-1 beta mediated, and IL-23 not involved. Then we will hUC-MSCs and sources of SLE in patients with PBMCs cells were co cultured in vitro, the ability of IL-17 and hUC-MSCs can promote SLE secretion of patients, but did not affect the secretion of IL-23. At the same time, hUC-MSCs reduced the number of Thl cells and increase the number of Treg cells.
Conclusion: in summary, our results are the first reported hUC-MSCs while promoting healthy donors and SLE patients. PBMCs and IL-1 beta IL-17.PGE2 may participate in hUC-MSCs this role. This finding may use for hUC-MSCs points in SLE patients the potential pathogenicity. Considering the correlation between IL-17 content and the activity of SLE in serum of patients with the disease. The clinical application of hUC-MSCs treatment of SLE may require more careful research.

【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1516792