發(fā)布時(shí)間：2018-02-14 11:48

  本文關(guān)鍵詞： 戊型肝炎病毒 顆粒性抗原 疫苗 T細(xì)胞表位 免疫原性 抗原性　出處：《廈門大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 大腸桿菌表達(dá)的戊型肝炎病毒(HEV)衣殼蛋白ORF2的aa394-606片段NE2可以體外形成同源多聚體,其N端延伸突變體HEV 239蛋白(ORF2 aa368-606)在體外可以自發(fā)組裝成類病毒顆粒。二者具有近乎完全一致的抗原性,但HEV 239的免疫原性比可溶的非顆粒蛋白NE2強(qiáng)200倍左右。有研究表明,顆粒蛋白抗原比可溶性抗原能夠更加有效的被抗原遞呈細(xì)胞捕獲從而具有更強(qiáng)的免疫原性,亦有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為,這是由于顆�？乖芨行У募せ頑細(xì)胞。因此對HEV 239與NE2的研究將能使我們更好的了解顆�？乖c可溶性抗原免疫原性差別產(chǎn)生的原因,并為將來合理的設(shè)計(jì)開發(fā)基因工程亞單位疫苗提供新的思路。 本文第一部分研究了239蛋白與NE2蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。用鋁佐劑吸附的239蛋白與NE2蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,免疫兩周后取其脾細(xì)胞,用IL-5-ELISPOT與IFN-γ-ELISPOT方法來測定脾細(xì)胞中抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量與類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),239比NE2能激活更強(qiáng)的Th1與Th2應(yīng)答,這可能是NE2蛋白免疫原性較弱的原因之一。 本文第二部分利用覆蓋HEV 239蛋白全長的15AA肽庫(相鄰肽段重疊10AA)做為IFN-γ-ELISPOT實(shí)驗(yàn)中的刺激原初步篩選HEV 239蛋白的H-2~d限制的T細(xì)胞表位。結(jié)果顯示肽段P34(序列:HSKTFFVLPLRGKLS)有較強(qiáng)的反應(yīng)性而P35(:序列FVLPLRGKLSFWEAG)有中等強(qiáng)度的反應(yīng),其他肽段無反應(yīng)。對P34與P35肽中所含T細(xì)胞表型的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肽P34為優(yōu)勢Th表位肽而肽P35包含一較弱CTL表位和來自P34肽的部分Th表位活性。 本文第三部分用IFN-γ-ELISPOT實(shí)驗(yàn)來定量分析不同濃度的239與NE2蛋白體外激活P34-CFA免疫小鼠脾細(xì)胞的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度的239與NE2都能激活P34特異的T細(xì)胞,而在低濃度抗原的情況下,239仍能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答而NE2不能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,只有高濃度的NE2才能激活T細(xì)胞應(yīng)答,而在疫苗免疫的過程中無法實(shí)現(xiàn)高的局部抗原濃度,因此NE2很難有效的激活T細(xì)胞應(yīng)答。而為了驗(yàn)證激活Th細(xì)胞能力對于NE2蛋白免疫原性的影響,用P34,P35與P18(陰性對照)CFA初免小鼠后再腹腔加強(qiáng)5,10,20μg鋁佐劑吸附的NE2蛋白,并對免疫后三周的小鼠血清中抗HEV抗體的進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P34、P35均對NE2有初免效果,能幫助此劑量的NE2產(chǎn)生抗體應(yīng)答,但P34的效果比P35強(qiáng),而P18無初免效果。但是P34初免NE2加強(qiáng)的抗體反應(yīng)仍弱于低劑量239蛋白誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。這說明不能有效激活T細(xì)胞是NE2抗原性較弱的原因,但不是唯一原因。 本研究的第四部分主要比較NE2與239蛋白活化B細(xì)胞能力的差異,將0.2,2,20,100μg鋁佐劑吸附的HEV 239與NE2蛋白腹腔免疫Balb/c裸鼠,每組三只,檢測免疫后第7天與第14天裸鼠血清中抗HEV抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅0.2μgHEV 239就能誘導(dǎo)非T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答,而100μg的NE2蛋白仍無法誘導(dǎo)可檢出的非T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答。這說明活化naive B細(xì)胞的能力不同也有可能是NE2與239具有相同的抗原性但不同免疫性的原因之一。 最后,本文的第五部分主要將前面實(shí)驗(yàn)獲得的H-2~d限制的Th表位應(yīng)用于單克隆抗體的生產(chǎn),對一無法利用基因工程技術(shù)表達(dá)的禽流感抗原,化學(xué)合成包含其B細(xì)胞表位與本研究獲得的H-2~d限制的Th表位的肽段,將此肽段與CFA混合后免疫小鼠,最后我們獲得了一株B表位特異的單克隆抗體。 總之,本研究精確定位了HEV 239蛋白的H-2~d限制的Th表位與CTL表位,初步的闡明造成顆粒性抗原與可溶性抗原免疫原性差別的原因,為今后疫苗的研究開發(fā)提供了新的思路。最后,利用實(shí)驗(yàn)中獲得的Th表位協(xié)助一B表位獲得表位特異的單克隆抗體。
[Abstract]:Hepatitis E virus expressed in Escherichia coli (HEV) aa394-606 fragment of NE2 capsid protein ORF2 in vitro can form homo oligomers, the N mutant HEV protein 239 terminal extension (ORF2 aa368-606) in vitro can spontaneously assemble into virus like particles. The two have almost identical antigenicity of HEV 239, but the ratio of primary immune non soluble granule protein NE2 200 times. Studies have shown that particle protein antigen can be more effective than soluble antigen by antigen presenting cell capture immunogenicity which is more, also have reported in the literature that this is due to the particle antigen can effectively activate B cells. So the research on HEV 239 and NE2 will enable us to better understand granular antigen and soluble antigen immunogenicity difference, and provide new ideas for the design and development of genetic engineering subunit vaccine of reasonable future.
The first part of this research 239 protein and NE2 protein to induce T cell immune response. 239 protein and NE2 BALB/c mice were immunized subcutaneously with aluminum adjuvant adsorption, two weeks after immunization and the spleen cells, using IL-5-ELISPOT and IFN- gamma -ELISPOT method to determine the number and type of antigen specific T cells in spleen cells 239. The results showed that NE2 could activate Th1 and Th2 than the stronger response, which may be one of the reasons of weak immunogenicity of NE2 protein.
In the second part, by covering the full-length 15AA HEV 239 protein peptide library (adjacent peptides overlapping 10AA) as IFN- gamma in the -ELISPOT experiment to stimulate the primary screening of HEV 239 protein H-2~d restricted T cell epitopes. The results showed that the peptide P34 (sequence: HSKTFFVLPLRGKLS) with reactive P35 (strong: the sequence of FVLPLRGKLSFWEAG) had moderate reaction, other peptides without reaction. Further research on the phenotype of T cells containing P34 and P35 peptides found in peptide P34 was the dominant Th epitope peptide and peptide P35 contains a weak CTL epitope and P34 peptide from Th epitope.
The third part of the ability of IFN- gamma -ELISPOT experiment to quantitative analysis of different concentrations of P34-CFA 239 and NE2 protein in vitro activated immune spleen cells in mice. The results showed that high concentration of 239 and NE2 could activate P34 specific T cells, and in the low concentration of antigen, 239 can induce T cell response NE2 not only. The experimental results show that the high concentration of NE2 can activate T cell responses, and in the process of vaccine could not achieve high local concentration of antigen, so it is difficult for the activation of NE2 T cell responses. In order to verify the ability to activate Th cells to influence the immunogenicity of NE2 protein by P34 P35. With P18 (negative control) NE2 protein in mice after intraperitoneal free 5,10,20 g strengthened aluminium adjuvant adsorbed CFA, and anti HEV antibody in serum for three weeks after immunization in the detection, experimental results show that P34, P35 have a primary immune effect on NE2, can Help this dose of NE2 antibody response, but the effect of P34 is stronger than P35, while P18 had no effect. But the early free antibody response to P34 prime NE2 strengthening is still weaker than low dose 239 protein induced antibody response. It shows that you can't effectively activate NE2 is weak antigenicity of T cells, but it is not the only reason.
The fourth part of this study, the main difference between NE2 and 239 proteins of B cell activation, 0.2,2,20100 g aluminum adjuvant adsorbed HEV 239 and NE2 protein in nude mice by intraperitoneal immune Balb/c, three rats in each group, detected seventh days after immunization and fourteenth days of serum anti HEV antibody in nude mice. The results showed that the antibody response is only 0.2 ~ gHEV 239 can induce T cell dependent antibody response, and 100 g NE2 protein is not detectable by non T cell dependent. This shows that the ability of activated naive B cells may also be different is NE2 and 239 have the same antigenicity but different immunity is one of the reasons.
Finally, the fifth part of this paper will be in front of the experiments of H-2~d restricted Th epitopes used in the production of monoclonal antibodies against avian influenza A antigen, cannot be expressed by using genetic engineering technique, including chemical synthesis of B cell epitope peptide and the acquired H-2~d restricted Th epitopes, this peptide with the mixture of CFA mice. Finally we got a strain of monoclonal antibody B specific epitope.
In short, the accurate positioning of the Th HEV 239 protein and H-2~d restricted CTL epitopes, preliminary clarify the cause of granular antigen and soluble antigen immunogenicity difference, provides new ideas for the future development of vaccine research. Finally, using the obtained Th epitope to B epitope epitope specific monoclonal antibodies.

【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1510636