本文關(guān)鍵詞： 創(chuàng)傷弧菌 內(nèi)毒素 溶細(xì)胞毒素 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 增殖抑制 損傷體視學(xué)參數(shù)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景和目的： 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus, Vv)是弧菌屬第五群細(xì)菌,革蘭染色陰性,彎曲、桿狀、多形性、運(yùn)動(dòng)活潑、有莢膜的細(xì)菌,主要生長于海水中的魚類及貝母類等體內(nèi),為嗜鹽性海生弧菌。可分為3種生物型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),其中Ⅰ型是導(dǎo)致人類創(chuàng)傷感染和原發(fā)性敗血癥的主要致病菌,一般通過外傷接觸含病菌的海水或生食海鮮兩種途徑感染。因此創(chuàng)傷弧菌感染是海上創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中的重要問題,也是海產(chǎn)品食品衛(wèi)生中的重要問題。其感染后可引起人體嚴(yán)重感染、膿毒敗血癥,其引發(fā)的多器官功能障礙綜合癥是膿毒敗血癥患者死亡的主要原因,病死率高達(dá)50%以上。創(chuàng)傷弧菌膿毒敗血癥的形成主要是大量的創(chuàng)傷弧菌侵入到血液之中,而血管內(nèi)皮細(xì)胞是阻擋創(chuàng)傷弧菌進(jìn)入血管的重要屏障。因此,創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制是創(chuàng)傷弧菌敗血癥形成機(jī)制中的重要問題。 為揭示創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用,闡明創(chuàng)傷弧菌感染時(shí)對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響,我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究,為臨床創(chuàng)傷弧菌感染的診治提供一定的理論依據(jù)。 方法： 1.創(chuàng)傷弧菌一般特性觀察和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響： 1.1創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562,購自中國科學(xué)院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。復(fù)蘇培養(yǎng)后,行革蘭氏染色,光鏡觀察,劃線接種于硫代硫酸鹽—枸櫞酸鹽——膽鹽—蔗糖瓊脂(thiosulfate-cifrae-bile salt-sucrose, TCBS)平板及普通營養(yǎng)瓊脂平板觀察其菌落形態(tài),并接種于弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后,機(jī)讀細(xì)菌鑒定結(jié)果。 1.2人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell, HU),由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科提供,對(duì)其進(jìn)行VIII因子免疫熒光鑒定。我們通過本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的攻擊濃度進(jìn)行了界定,并通過96孔板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及MTT法對(duì)不同濃度的創(chuàng)傷弧菌侵襲過的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行增值抑制率的測定；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測量不同濃度的創(chuàng)傷弧菌對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞侵襲后即刻及24h細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀測定不同濃度Vv對(duì)HU細(xì)胞凋亡的影響,選擇攻擊實(shí)驗(yàn)Vv的最高的實(shí)驗(yàn)終濃度103cfu/ml。通過Hoechest 33342熒光染色觀察HU細(xì)胞核的變化；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力的變化,以及50個(gè)高倍視野下正常細(xì)胞與侵襲后細(xì)胞核分裂數(shù)的變化,觀察極限殺傷濃度下細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。對(duì)正常組和創(chuàng)傷弧菌攻擊組(104cfu/ml)的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、胞漿面積(Acp)、核漿比(Rnp)以及細(xì)胞與核的長軸(dmaxc, dmaxn),細(xì)胞與核的短軸(dminc dminn),軸比(Rac、Ran),細(xì)胞與核的形狀因子PE (PEc、PEn),細(xì)胞與核的形狀因子AR (ARc、ARn),細(xì)胞與核的規(guī)劃形狀因子RFF (RFFc、RFFn),形狀不規(guī)則指數(shù)FⅡ(FⅡc、FⅡn)等參數(shù)的體視學(xué)測量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧菌攻擊下增殖能力和細(xì)胞形態(tài)的改變。 2、創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素的提取、鑒定以及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 2.1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌,利用酚水法提取細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS),并對(duì)LPS進(jìn)行離心純化,以及根據(jù)2005版《中國藥典》規(guī)定用內(nèi)毒素測定方法“鱟試劑”對(duì)其進(jìn)行鑒定,并繪制濃度曲線,確定所提取的細(xì)菌LPS的濃度。 2.2根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度,選擇其上下濃度域共4個(gè)濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行MTT,平板克隆,劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力的改變,以及流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率的測定。對(duì)正常組和內(nèi)毒素10000EU/ml攻擊組的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、周長(Cn)、細(xì)胞的體積(V),以及細(xì)胞的體積密度(Vv)、表面積密度(Sv)、數(shù)密度(Nv)等參數(shù)的體視學(xué)測量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧菌攻擊下增殖能力和細(xì)胞以及細(xì)胞核形態(tài)的改變,以判斷細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。 3、創(chuàng)傷弧菌外毒素的鑒定和濃度的測定,以及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 3.1本課題組前期已重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3),行藍(lán)白斑篩選,挑選白色菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVVC),對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證,采用BCA (bicichoninicacid)法進(jìn)行蛋白定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋白濃度。對(duì)SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔皮下多點(diǎn)注射,50mg/kg,小鼠處死后對(duì)其立即解剖,取主要損傷臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色,光鏡下觀察病理變化。 3.2根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度,選擇其濃度域上下共4個(gè)濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行MTT,平板克隆,劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力,并用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率的測定。對(duì)正常組和溶細(xì)胞毒素3EU／ml攻擊組的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、周長(Cn)以及細(xì)胞的體積密度(Vv)、表面積密度(Sv)、數(shù)密度(Nv)等參數(shù)的體視學(xué)測量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVVC)攻擊下增殖能力和細(xì)胞形態(tài)的改變,以判斷細(xì)菌溶細(xì)胞毒素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。 結(jié)果： 創(chuàng)傷弧菌1.1758株在TCBS平板上生長為綠色菌落,有光澤,為典型的粘液菌落；普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長為黃白色粘液半透明菌落。生化鑒別結(jié)果：“創(chuàng)傷弧菌%id(符合率)=98probablitity"。 1、創(chuàng)傷弧菌對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞形態(tài)的影響 (1)通過96孔板培養(yǎng)法和MTT法對(duì)不同濃度創(chuàng)傷弧菌侵襲過的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線以及吸光率的測定,10cfu/ml組、102cfu/ml組、103cfu/ml組、104cfu/ml組細(xì)胞24h增殖抑制率分別為：(10.27±7.17)%,(16.13±14.33)%,(26.01±6.45)%,(37.46±5.06)%；48h增殖抑制率分別為：(13.12±8.60)%,(26.63±5.42)%,(34.20±7.92)%,(42.63±3.58)%；72h增殖抑制率分別為：(16.50±5.92)%,(28.93±5.48)%,(38.93±4.94)%,(49.62±20.35)%：96h增殖抑制率分別為：(25.444±8.15)%,(36.41±15.31)%,(45.37±14.51)%,(52.81±10.51)%。(2)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測對(duì)照組和不同濃度創(chuàng)傷弧菌攻擊后的4組HU細(xì)胞的即刻存活率和24h存活率,即刻存活率分別為100％、100%、99.48%、99.38%、98.55%；24h細(xì)胞存活率分別為100%、96.90％、88.48％、76.78%、57.65%。(3)流式細(xì)胞儀測定不同濃度Vv對(duì)HU細(xì)胞凋亡的影響,創(chuàng)傷弧菌攻擊組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組；(4) Hoechest 33342熒光染色觀察HU細(xì)胞核,空白對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核呈均勻的藍(lán)色熒光,加入創(chuàng)傷弧菌24h后,低濃度組10cfu/ml時(shí)開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,到創(chuàng)傷弧菌達(dá)到104cfu/ml時(shí)凋亡細(xì)胞迅速增多,呈圓形或橢圓形的高亮藍(lán)色熒光,可見明顯的染色質(zhì)凝集。(5)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組克隆形成率為63.73%,10cfu/ml組為39.60%,比Control組下降37.86%；104cfu/ml組為15.53%,比Control組下降91.17%；比10cfu/ml組下降了60.79%。(6)50個(gè)高倍視野下正常細(xì)胞核分裂數(shù)平均為0.640±0.563,與103cfu/ml組細(xì)菌侵襲后細(xì)胞核分裂數(shù)為4.740±0.751。(7)正常組和104cfu/ml細(xì)菌攻擊組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)測試結(jié)果如下：長軸(μm)分別為：36.17±14.34和30.244±8.21,短軸(μm)分別為：15.644±7.32和22.37±5.73,細(xì)胞面積(μm2)分別為：431.26±296.37和537.644±239.285,細(xì)胞周長(μm)分別為：82.20±26.10和132.69±30.66,軸比分別為：2.61±1.19和1.39±0.38,PE分別為：0.33±0.11和0.444±0.13,AR分別為：0.90±0.12和0.97±0.05,RFF分別為：0.644±0.12和0.66±0.10,FII分別為：1.80±0.30和1.56±0.28,細(xì)胞核面積(μm2)分別為：133.70±26.23和143.07±27.85,胞漿面積(μm2)分別為：312.72±268.04和371.34±237.87,核漿比分別為：0.25±0.10和0.75±0.55。(8)正常組HUVEC細(xì)胞大部分呈梭形,胞漿粉染,核圓形或卵圓形,核仁較明顯。創(chuàng)傷弧菌104cfu/ml攻擊組HUVEC細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清,胞漿淡染,可見微小空泡結(jié)構(gòu)形成；核染色變淺,核仁碎裂,呈消溶態(tài)。 2、創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素(LPS)的提取、鑒定以及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 運(yùn)用酚水法提取的創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素(LPS),經(jīng)高速離心純化,鱟試劑鑒定,以及酶標(biāo)儀單波長405nm處測量吸光度,根據(jù)比色算出所提取的內(nèi)毒素濃度為20434EU/ml. (1)用MTT法對(duì)不同濃度創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素侵襲過的血管內(nèi)皮細(xì)胞吸光率進(jìn)行測定,得出不同濃度細(xì)菌對(duì)HU細(xì)胞的增殖抑制率2500EU/ml、5000EU/ml、7500EU/ml、10000EU/ml24h的增殖抑制率分別為(1.554±0.409)％、(4.762±0.690)%、(4.028±0.743)%、(47.440±4.716)%；48h的增殖抑制率分別為(1.262±0.494)%、(2.893±1.166)%、(15.498±6.786)%、(59.591±5.696)%；72h的增殖抑制率分別為(1.459±0.458)%、(6.649±0.588)%、(14.074±4.088)%、(48.525±2.159)%；96h的增殖抑制率分別為：(4.248±1.312)%、(8.977±2..089)%、(22.929±3.696)％、(56.342±9.336)％。(2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組克隆形成率為72.73%,10000EU/ml組為40.13%,比Control組下降44.82%。(3)流式細(xì)胞儀測定LPS對(duì)HU細(xì)胞凋亡的影響,LPS攻擊組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組。(4)正常組和終濃度10000EU／m的細(xì)菌內(nèi)毒素攻擊組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)測試結(jié)果如下：細(xì)胞核的面積(μm2)分別為：135.80±26.37和150.43±32.69,細(xì)胞核周長(μm2)分別為：32.00±6.08和70.67±13.87,細(xì)胞面積(μm2)分別為：415.43±72.00和442.26±69.74,細(xì)胞周長(μm)分別為：141.06±30.75和133.10±17.55,胞漿面積(μm2)分別為：93.55±20.31和303.50±61.33,核漿比分別為：0.44±0.09和0.65±0.15,體積密度分別為：0.35±0.44和0.30±0.04,數(shù)密度分別為：0.00016±0.000042和0.00014±0.000045,表面積密度分別為：39.05±8.21和81.93±16.17。 3、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素的鑒定和濃度的測定及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 對(duì)本課題組前期所合成的創(chuàng)傷弧菌外毒素進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證融合蛋白rWC,在凝膠上70KD時(shí)出現(xiàn)蛋白條帶(創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素分子量約為50KD,載體蛋白約為20KD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及其相應(yīng)的吸光度值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所測得的稀釋樣品的吸光度值,計(jì)算出相應(yīng)的蛋白樣品的濃度為4000.282ug/ml。選擇50mg/kg濃度的VVC對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔皮下多點(diǎn)注射,24h后用斷椎法處死小鼠,取主要損傷臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色,光鏡下觀察小鼠的肺臟出現(xiàn)出血性損傷；肝臟組織局部細(xì)胞呈現(xiàn)灶狀、片狀壞死,有膿腫樣改變；其余臟器幾無損傷,表明我們所合成的VVC具有明確的生物活性,用其作用于培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)果表明：(1)用MTT法對(duì)不同濃度創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(VVC)侵襲過的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線以及吸光率進(jìn)行測定(我們將創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素?fù)Q算成國際單位),2EU/ml、2.5EU/ml、3EU/ml、3.5EU/ml24h的增殖抑制率分別為(3.31±5.61)%、(3.61±8.22)%、(50.31±2.82)%、(55.11±4.52)%；48h的增殖抑制率分別為(3.22±14.21)%、(3.74±7.91)%、(50.7±1.52)%、(58.71±50.71)%；72h的增殖抑制率分別為(6.33±1.91)％、(9.14±10.72)%、(54.23±5.71)%、(55.7±2.13)%；96h的增殖抑制率分別為(4.21±4.23)％、(5.92±11.82)%、(50.11±0.7)%、(54.33±0.9)%。(2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組克隆形成率為67.87％,3EU/ml組為33.47%,比Control組下降52.10%。(3)流式細(xì)胞儀測定細(xì)菌外毒素對(duì)HU細(xì)胞凋亡的影響,VVC攻擊組細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組。正常對(duì)照組、：3EU/ml和3.5EU/ml創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素攻擊組正常細(xì)胞指數(shù)為：97.43％、47.98％、35.07%；凋亡細(xì)胞指數(shù)分別為：1.77%、51.21%、61.30%。(4)正常組和3EU/ml細(xì)菌外毒素(VVC)攻擊組細(xì)胞的參數(shù)值分別為：細(xì)胞核的面積(μm2)分別為：135.80±26.37和147.77±40.62,細(xì)胞核周長(μm)分別為：32.00±6.08和91.99±18.30,細(xì)胞面積(μm2)分別為：415.43±72.00和240.80±77.77,細(xì)胞周長(μm)分別為：141.06±30.75和125.83±26.77,胞漿面積(μm2)分別為：93.55±20.31和70.62±30.11,核漿比分別為：0.42±0.08和2.40±3.59,體積密度分別為：0.35±0.04和0.66±0.16,數(shù)密度分別為：0.00016±0.000042和0.00029±0.00013,表面積密度分別為：39.05±8.21和214.19±62.76。 結(jié)論 創(chuàng)傷弧菌對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的殺傷作用,其殺傷濃度閾值為103cfu/ml。創(chuàng)傷弧菌、創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素(LPS)、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(VVC)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HU)的增殖有明顯的抑制作用,其抑制能力與創(chuàng)傷弧菌作用的濃度和時(shí)間有關(guān),與創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素(LPS)、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(VVC)作用的濃度有關(guān)；均能改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)并可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。且通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以觀察到：溶細(xì)胞毒素可以明顯損傷小鼠的肝臟和肺臟組織。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄭晶;創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶的基因克隆、蛋白表達(dá)、抗體制備及其致病性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王貴明;創(chuàng)傷弧菌消殺抗性及其菌體抗原、溶細(xì)胞毒素蛋白抗原主動(dòng)免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

本文編號(hào)：1506960