本文關鍵詞： 蓖麻毒素 蓖麻毒素A鏈 中和抗體 計算機輔助分子設計 親和力提高 虛擬篩選 小分子拮抗化合物　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的:蓖麻毒素(ricin)是從植物蓖麻種子中分離得到的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白,其A鏈(RTA)為效應鏈,通過B鏈(RTB)幾乎可以和所有的真核細胞結(jié)合。一分子ricin進入細胞內(nèi),在一分鐘內(nèi)就可以使1777個核糖體失活,從而很快殺死整個細胞。ricin制成粉劑、水溶劑后性質(zhì)穩(wěn)定,經(jīng)呼吸道吸入、消化道攝入和肌肉注射等均可致人中毒,以氣溶膠或肌肉注射對人的致死劑量估計為5~10μg/kg體重,其毒性是有機磷神經(jīng)毒劑VX的385倍,是氰化物的6000倍。ricin生產(chǎn)原料蓖麻籽來源廣泛,提取制備方法簡便,很容易被恐怖分子利用,因此研究ricin及RTA的拮抗劑具有重要的現(xiàn)實意義。 內(nèi)容、方法:本室通過常規(guī)免疫Balb/c小鼠,獲得了多株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗ricin中和抗體,體外和體內(nèi)實驗均顯示出一定的中和活性。本文在合理評價鼠源抗體功能的基礎上,對具有高中和活性的鼠源功能抗體進行人源化改造獲得嵌合抗體;借助本室建立的“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設計新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺,利用輕重鏈CDR區(qū)定點突變對嵌合抗體進行體外親和力成熟改造;基于RTA及RTA-底物類似物復合物的晶體結(jié)構(gòu),ricin與功能抗體4C13_Fv作用復合物空間構(gòu)象,利用計算機虛擬篩選方法,獲得新型拮抗RTA先導化合物。研究內(nèi)容及方法概括如下: 1、對具有中和活性的鼠源功能抗體進行人源化改造 在鑒定3株小鼠抗ricin單克隆抗體的中和活性的基礎上,選擇中和活性最高的鼠源抗體4C13作為人源化改造的親本抗體,釣取雜交瘤細胞輕重鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建嵌合抗體表達載體,瞬時共轉(zhuǎn)染293T細胞,運用ELISA、Western blot及細胞毒實驗鑒定表達抗體的抗原識別特異性、中和活性,并測定其相對親和常數(shù); 2、計算機輔助設計提高嵌合抗體C4C13親和力與評價 通過計算機輔助分子模擬對抗體4C13可變區(qū)Fv三維結(jié)構(gòu)進行合理搭建,并通過力學優(yōu)化獲得其穩(wěn)定的三維構(gòu)象。利用已解析的ricin晶體結(jié)構(gòu),通過分子對接獲得4C13_Fv片段與ricin相互作用的復合物模型,經(jīng)計算機圖形學技術(shù)、計算生物學相關理論,預測抗原抗體相互識別區(qū)域、關鍵氨基酸殘基及作用模式;同時依據(jù)相互作用自由能、分子間氫鍵、疏水作用等,設計嵌合抗體C4C13突變體并對其親和力進行理論預測。根據(jù)突變體序列設計引物,利用重疊PCR技術(shù)擴增目的基因,構(gòu)建相應的突變體真核表達載體進行瞬時表達,通過ELISA、Western Blot、競爭結(jié)合實驗等手段對表達抗體的抗原識別特異性及親和力大小進行相應的檢測。 3、基于RTA及RTA-底物類似物復合物晶體結(jié)構(gòu)虛擬篩選小分子拮抗化合物 根據(jù)RTA的晶體結(jié)構(gòu)、RTA與其底物類似物的晶體結(jié)構(gòu)、ricin與4C13_Fv作用復合物結(jié)構(gòu),結(jié)合RTA突變體實驗結(jié)果,合理確定RTA的脫嘌呤功能區(qū)域。通過計算機圖形學技術(shù),借助距離幾何學、分子間氫鍵形成理論,利用確定的RTA功能活性區(qū)域結(jié)構(gòu)特征,合理確定藥效團特征,進而形成與RTA功能域作用位點模式,通過ACD化合物數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選。利用分子對接對篩選獲得的化合物進行理論評估,確定能夠成為RTA抑制劑的先導化合物。選擇pET32a載體原核表達RTA,并檢測其生物學活性;在分子水平選用兔網(wǎng)織紅細胞裂解液蛋白合成體系實驗探討化合物抑制RTA的毒性作用;在細胞水平選擇對RTA敏感的小鼠骨髓瘤細胞—SP2/0細胞分析化合物拮抗RTA的生物學功能,以此評估篩選先導化合物的活性。 結(jié)果:1、對具有中和活性的鼠源功能抗體進行人源化改造:以小鼠骨髓瘤細胞SP2/0建立ricin細胞毒模型,鑒定并選擇中和活性最高的鼠源抗體4C13作為人源化改造的親本抗體;釣取輕重鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建了真核表達載體pCMV_4C13_VH和pCMV_4C13_VL,實現(xiàn)了嵌合抗體在真核細胞中的瞬時表達,生物學實驗顯示,C4C13保持了親本抗體的識別特異性和中和活性。 2、計算機輔助設計提高嵌合抗體C4C13親和力與評價:利用分子對接構(gòu)建穩(wěn)定的4C13_Fv/ricin相互作用的復合物模型,預測抗原—抗體作用模式并確定影響抗體親和力的三個關鍵氨基酸殘基,進一步設計了突變體(M1) VH-N102F,VH-W103Y,(M2)VH-W103Y;(M3) VL-R90G,并對其親和力進行理論預測;通過ELISA、Western Blot、競爭結(jié)合實驗等手段對表達抗體的抗原識別特異性及親和力大小進行相應的檢測,親和力高低依次為:M1M2C4C13M3,實驗結(jié)果與理論預測結(jié)果一致,提示獲得的4C13_Fv/ricin作用復合物結(jié)構(gòu)是合理的。 3、基于RTA、RTA-底物類似物復合物晶體結(jié)構(gòu)及4C13_Fv/ricin相互作用的復合物模型虛擬篩選小分子拮抗化合物:通過虛擬篩選ACD化合物數(shù)據(jù)庫獲得4種小分子化合物,原核表達的rRTA顯示了良好的生物學活性,在無細胞蛋白合成體系實驗中,四個化合物與陽性對照都表現(xiàn)出一定的拮抗RTA的活性,細胞毒實驗中,化合物3025對rRTA顯示出較好的濃度依賴的抑制效應。 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了嵌合抗蓖麻毒素中和抗體C4C13,并保持了親本抗體的識別特異性和中和活性,其鼠源序列下降了70%,有效降低了在臨床應用中可能產(chǎn)生的人抗鼠抗體(HAMA)反應,提高了治療的有效性;借助“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設計新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺,成功搭建了ricin與功能抗體4C13 _Fv作用復合物模型,并對嵌合抗體進行體外親和力成熟改造;利用計算機虛擬篩選方法獲得RTA拮抗先導化合物,生物學實驗證實,獲得的先導化合物能夠阻斷RTA的生物學功能,為進一步研發(fā)RTA小分子拮抗劑奠定了基礎。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 王景林;蓖麻毒素生物恐怖及其醫(yī)學防護[J];科技導報;2003年07期

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本文編號：1503455