本文關(guān)鍵詞： Cajal細胞 KIT受體 BrdU 干細胞因子 c-kit 平滑肌細胞 腸梗阻　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： Cajal細胞(Interstitial cells of Cajal, ICCs)作為一種特殊的間質(zhì)細胞,以細胞網(wǎng)絡(luò)的形式分布于整個胃腸道。近二十余年,國內(nèi)外學(xué)者通過對胃腸壁內(nèi)ICCs的形態(tài)特征、超微結(jié)構(gòu)、起源及生理功能等一系列研究表明:ICCs具有產(chǎn)生自發(fā)性電慢波、參與神經(jīng)信息整合與傳遞等功能,對胃腸平滑肌運動具有重要調(diào)節(jié)作用。 近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)ICCs數(shù)量減少與一些胃腸運動功能障礙性疾病:例如糖尿病胃輕癱、慢傳輸型便秘、Crohn’s病、術(shù)后胃腸運動功能障礙等密切相關(guān)。盡管上述疾病的發(fā)生機制尚不清楚,但均有一個共同的病理變化:即病變部位胃腸壁內(nèi)ICCs數(shù)量呈不同程度減少,甚至缺如,ICCs彼此間及其與平滑肌細胞間不能形成完整的細胞網(wǎng)絡(luò)。但因?qū)ι鲜黾膊〉陌l(fā)病機理及ICCs減少、細胞網(wǎng)絡(luò)完整性被破壞的原因等尚不清楚,一直是臨床治療的難題。設(shè)想如果能夠闡明促進ICCs細胞網(wǎng)絡(luò)完整性恢復(fù)的調(diào)控機制,勢必為臨床相關(guān)疾病的治療提供有益的思路。 ICCs表達c-kit基因產(chǎn)物,一種原癌基因編碼的受體酪氨酸激酶(Kit)。它的配體是干細胞因子(stem cell factor,SCF),由平滑肌和神經(jīng)產(chǎn)生。在Kit或SCF基因突變的小鼠和大鼠,以及用Kit中和性抗體或Kit受體阻斷劑在胚胎晚期或生后早期阻斷Kit受體功能,將引起ICCs數(shù)量明顯減少或丟失,伴有胃腸運動功能障礙,表明胚胎期ICCs的發(fā)育、存活及形態(tài)的維持需要Kit/SCF信號通路功能的正常。 體外研究亦發(fā)現(xiàn),在外源性SCF的作用下,培養(yǎng)的小鼠小腸ICCs具有一定的增殖能力,但這種增殖僅見于生后6天前的新生鼠,提示ICCs的增殖具有時間依賴性和SCF依賴性。我們的研究發(fā)現(xiàn),小腸半橫斷吻合術(shù)后,吻合部位丟失的ICCs隨時間的經(jīng)過能夠逐漸恢復(fù)正常的數(shù)量和分布模式,提示成年動物ICCs仍具有一定的增殖能力,且與平滑肌表達SCF有關(guān),提示Kit/SCF信號通路可能參與了這一過程。 已知成年哺乳動物胃腸壁內(nèi)ICCs持續(xù)表達c-kit及其產(chǎn)物KIT蛋白,KIT/SCF信號通路對發(fā)育成熟的ICCs是否具有與胚胎期相似的作用尚不清楚。抑制成年哺乳動物Kit信號通路后,ICCs是否減少?發(fā)生凋亡或者轉(zhuǎn)分化?丟失后能否恢復(fù)正常分布?在此過程中Kit/SCF信號通路的作用如何均亟待闡明。此外,腸梗阻等胃腸運動功能障礙性疾病ICCs丟失后能否恢復(fù)正常分布以及Kit/SCF信號通路的是否參與這一過程的調(diào)節(jié)均不清楚。因此,探討Kit/SCF信號通路對成熟ICCs可塑性的調(diào)控機制將有利于理解胃腸運動功能障礙性疾病的發(fā)病機制,同時為臨床相關(guān)疾病的治療開辟新的策略。 本實驗分為兩個部分: 第一部分: Imatinib是Kit受體的特異性抑制劑。本研究給成年小鼠和豚鼠連續(xù)口服Imatinib,利用Kit和Vimentin免疫熒光染色觀察阻斷Kit信號通路后,ICCs的數(shù)量和突起長度的變化,同時Kit/a-SMA雙重免疫熒光標(biāo)記觀察ICCs是否向平滑肌表型轉(zhuǎn)分化,以及體外灌流觀察小腸功能變化;停Imatinib處理后觀察ICCs恢復(fù)情況以及小腸功能變化,并用Kit/PCNA和Kit/BrdU雙重染色對各實驗組ICCs的增殖進行分析。 主要結(jié)果如下: 1、Imatinib處理后,成年豚鼠和小鼠小腸的ICCs數(shù)量逐漸減少,隨時間的延長尤為明顯,最多可減少1/2以上,同時自主節(jié)律性運動功能亦受到抑制。 2、ICCs數(shù)量減少的同時,可見Kit/a-SMA雙標(biāo)陽性ICC和Kit(-)/a-SMA(+)ICC樣細胞,提示ICCs可能向平滑肌的表型轉(zhuǎn)分化,但未見ICC出現(xiàn)凋亡。 3、停止Imatinib處理后,ICCs數(shù)量和功能逐漸恢復(fù)正常,與此同時可見大量的BrdU/Kit和PCNA/Kit雙標(biāo)陽性的細胞。 上述結(jié)果表明成年哺乳動物ICCs具有較強的可塑性,Kit信號通路對成熟ICCs的存活和增殖具有重要的調(diào)控作用,該信號通路功能障礙可能導(dǎo)致ICCs的發(fā)生轉(zhuǎn)分化,成熟ICCs具有較強的增殖能力。 第二部分: 制作小腸機械性腸梗阻模型,采用Kit及Kit/a-SMA單/雙重免疫熒光染色觀察梗阻期間和解除梗阻后ICCs的數(shù)量變化,Western Blot檢測SCF和Kit磷酸化(p-Kit)的變化,用Kit/BrdU雙重染色顯示成熟ICCs的增殖以及體外灌流檢測小腸運動功能變化,探討ICCs的數(shù)量變化與SCF表達及Kit信號通路激活或抑制的相關(guān)性。 主要結(jié)果如下: 1、梗阻期ICCs數(shù)量逐漸減少,梗阻14天靠近梗阻部位最明顯,并可見Kit/a-SMA雙標(biāo)陽性細胞,同時腸運動功能亦受到明顯的抑制; 2、在梗阻期SCF表達量和p-Kit均下降,靠近吻合口部位最明顯,約為正常的1/2到1/3,解除梗阻后,SCF和p-Kit恢復(fù)正常。 3、解除梗阻后,ICCs數(shù)量增加,逐漸恢復(fù)正常分布模式同時可見大量BrdU/Kit雙標(biāo)陽性細胞,與此同時小腸運動功能也恢復(fù)正常。 上述結(jié)果表明SCF表達的變化與Kit信號通路的抑制和激活密切相關(guān),同時Kit信號通路對成熟ICCs的存活、表型維持以及增殖等可塑性具有重要調(diào)節(jié)作用。 綜上所述,本研究初步證明了成熟ICCs具有較強的可塑性,這種可塑性與Kit/SCF信號通路密切相關(guān);Kit活性被抑制后ICCs可能向平滑肌的表型轉(zhuǎn)分化;解除抑制后,ICCs能夠恢復(fù)正常的數(shù)量和分布模式,其數(shù)量的增加與ICCs的增殖有關(guān);腸梗阻時,ICCs數(shù)量的減少和解除梗阻后數(shù)量的增加與平滑肌表達SCF的變化平行,提示胃腸運動功能障礙性疾病可能與平滑肌表達的SCF不足, Kit信號通路活性低下有關(guān)。靶向性提高SCF的表達或直接激活Kit信號通路可能是臨床治療相關(guān)疾病的策略之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：1500442