本文關鍵詞： 17β-雌二醇 內(nèi)皮祖細胞 PPT DPN 增殖 遷移　出處：《瀘州醫(yī)學院》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的：觀察17β雌二醇(17β-estradiol, E2)及其受體激動劑PPT(選擇性雌激素受體(ER)α激動劑)、DPN(選擇性雌激素受體(ER)β激動劑)對內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和遷移的影響。探討E2可能通過何種ER亞型起作用。方法：(1)臍帶血單個核細胞的分離：抽取健康足月孕產(chǎn)婦胎盤臍帶血60ml,按20U／ml加入普通肝素抗凝,采用明膠沉淀聯(lián)合密度梯度離心法分離獲得單個核細胞,并進行細胞活力計算(死細胞著藍色、活細胞不著色),活細胞占98%以上可進行接種,上述過程在四個小時內(nèi)完成。(2)誘導分化：將細胞以4×106／cm2密度接種于纖維連接蛋白包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中(4μg/cm2),加入5ml M199培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素(1萬單位(ml)、VEGF 50ng/ml、b-FGF 1ng/ml,置于5%C02、飽和濕度、37℃孵育箱中,成纖維細胞多于24小時以內(nèi)貼壁,24小時后取未貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)至第四天,用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細胞,加培養(yǎng)液培養(yǎng)至第七天,進一步用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細胞,貼壁細胞供試驗用。(3) EPCs鑒定：取細胞爬片先后加入硫氰酸熒光素標記荊豆凝集素I (FITC-UEA-I)、DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)孵育,熒光顯微鏡觀察；7d的EPCs進行CD133免疫熒光鑒定。(4)研究E2、PPT和DPN對EPCs增殖及遷移的影響。培養(yǎng)的EPCs分別加入不同濃度的E2、PPT和DPN進行細胞增殖實驗分析(WST)、顯微鏡下EPCs計數(shù)和流式細胞技術檢測EPCs細胞周期。另外將EPCs細胞懸液接種于Coster Transwell(膜直徑6.5mm,孔徑8um)的上層,下層加入600ul的培養(yǎng)液,并分別在培養(yǎng)液中加入不同濃度的E2、PPT和DPN孵育24h(實驗均設雙復孔)。于高倍鏡下計數(shù)定向遷移至濾膜下表面的細胞數(shù)目,研究E2、PPT和DPN對細胞遷移的影響。結果：(1)培養(yǎng)3-4天的單核細胞開始貼壁；7天后呈簇狀生長,并有一定方向性；9天可見多個血島樣細胞團出現(xiàn)。免疫熒光鑒定顯示90%的貼壁細胞呈雙熒光染色陽性,CD133免疫熒光檢測顯示綠色陽性率90%。(2)WST實驗分析發(fā)現(xiàn)E2及PPT能促進EPCs的增殖,呈濃度依賴性,而DPN對EPCs的增殖無明顯影響。E2在1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7 mol/L濃度下,450nm吸光光度值分別為0.3466±0.0132、0.5083±0.016、0.5397±0.020、0.4785±0.0189；PPT在同等濃度下其吸光光度值為0.3265±0.1290、0.4503±0.0210、0.5040±0.0161、0.4272±0.0220,各濃度的E2組和PPT組與空白對照組0.2961±0.0106相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)；DPN在同等濃度下其吸光光度值為0.2963±0.0141、0.3129±0.0483、0.2951±0.013、0.3016±0.0241,與空白對照組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)；同等濃度的E2及PPT與DPN組相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)；同等濃度的E2與PPT相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)手工計數(shù)顯示E2及PPT作用后EPCs數(shù)增多,在1×10-8mol/l濃度下分別為(2.83±0.29)×105個、(2.56±0.11)×105個,與對照組(2.21±0.09)×105個相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05),DPN(2.21±0.99)×105個與空白對照組無統(tǒng)計學意義(P0.05); E2、PPT與DPN組相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)；E2與PPT相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)細胞周期實驗表明E2及PPT作用后,S期的EPCs所占百分比為(17.26±3.89)%、(12.1±1.84)%,分別與空白對照組(2.93±0.15)%相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05), DPN (3.37±0.64)%與空白對照組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)；E2作用后G1期細胞所占比例為(72.5333±6.2645)%,分別與對照組(87.2667±7.9758)%、DPN(87.6±0.7104)%相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05),E2與PPT(77.3±5.2602)%相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)(5)細胞遷移實驗表明E2及PPT能促進EPCs的遷移,濃度在1×10-8mol/1時作用最強,E2在1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L濃度下遷移至下層細胞數(shù)分別為35.64±4.9、44.26±3.93、50.10±6.22、39.81±4.73個,PPT在同等濃度下為29.00±3.61、40.06±4.68、43.47±4.78、35.18±2.71,與空白對照組相比18.78±1.35個相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)；DPN為18.97±2.01個、22.13±4.14個、24.72±3.43個、20.48±4.35個,與空白對照組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)；同等濃度的E2及PPT與DPN組相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)；同等濃度的E2與PPT相比有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：E2及PPT能促進EPCs的增殖和遷移,使處于增殖期S期的細胞增多,PPT刺激作用不及E2, DPN無刺激作用。說明E2主要通過α受體亞型途徑刺激EPCs的增殖和遷移。
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【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 許遵鵬,廖燦,陳勁松,劉斌,吳韶清,辜少玲;流式細胞術分析凍存前后臍血CD34~+細胞的分布[J];臨床血液學雜志;2003年06期

2 崔斌,黃嵐,宋耀明,李愛民,晉軍,覃軍,于學軍,耿召華;冠心病患者循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與相關危險因素及冠狀動脈病變的關系[J];中華心血管病雜志;2005年09期

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本文編號：1491148