本文關(guān)鍵詞： IDO 骨髓來源樹突狀細(xì)胞 同種皮膚移植 移植排斥反應(yīng)　出處：《華中科技大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:以重組腺病毒為IDO表達(dá)載體(Ad-IDO),感染供者骨髓來源的DC,將其過繼輸注給受者,觀察高表達(dá)IDO的DC輸注對受者皮膚移植后體內(nèi)T細(xì)胞亞群分化的影響。同時在體外進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),檢測同種反應(yīng)T細(xì)胞亞群的分化特征,為闡明IDO抑制同種反應(yīng)T細(xì)胞分化而保護(hù)移植物提供實驗依據(jù)。 方法:以293T細(xì)胞為包裝細(xì)胞,擴(kuò)增重組的Ad-IDO(E1、E3區(qū)缺失;外源基因插入E1區(qū);以CMV為啟動子,以SV40polyA為加尾信號)。將擴(kuò)增的Ad-IDO感染供者骨髓來源的DC,與異基因受者小鼠來源的脾臟na?ve T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系中同種反應(yīng)T細(xì)胞亞群(Th1、Th17)的比例;將Ad-IDO轉(zhuǎn)染的供者骨髓來源的DC輸注異基因受者小鼠,對受者進(jìn)行皮膚移植,并在移植后取受者的脾臟、淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行流式檢測,以觀察其T細(xì)胞亞群的比例變化。 結(jié)果:一、用293T細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒,并對其進(jìn)行鑒定。 在293T細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中,Ad-IDO以及Ad對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的病變效應(yīng);PCR表明,重組腺病毒在多次復(fù)制后仍能穩(wěn)定整合IDO基因;免疫印跡結(jié)果表明,不同代數(shù)的Ad-IDO感染293T細(xì)胞,均能使其穩(wěn)定表達(dá)IDO蛋白。 二、高表達(dá)IDO的供者骨髓來源DC對受者T細(xì)胞亞群分化的影響 1、BMDC的培養(yǎng),腺病毒感染及IDO的表達(dá) 誘導(dǎo)培養(yǎng)BALB/c小鼠來源的BMDC,并用Ad-IDO及對照組腺病毒進(jìn)行感染。經(jīng)RT-PCR鑒定,感染了Ad-IDO的BMDC有IDO的mRNA表達(dá);經(jīng)Western Blot鑒定,感染后的BMDC可有效表達(dá)IDO蛋白。 2、IDO及其代謝產(chǎn)物L(fēng)-Kyn抑制同種反應(yīng)Th17與Th1分化 將感染了Ad-IDO的BMDC與對照組BMDC(BALB/c小鼠來源)分別與C57BL/6脾臟來源的T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。與BMDC及BMDC(Ad-control)組相比,BMDC(Ad-IDO)組的Th17及Th1明顯降低;同時設(shè)立了加入L-Kyn(IDO降解色氨酸的代謝產(chǎn)物)的組別,其Th17和Th1的比例也明顯降低。 3、體內(nèi)輸注供者來源IDO高表達(dá)DC顯著抑制同種反應(yīng)性Th1而對Th17無明顯影響 將BALB/c小鼠來源的BMDC過繼輸注給C57BL/6小鼠,并進(jìn)行背部的皮膚移植,于移植后不同時間點取受者的脾臟、引流淋巴結(jié),檢測其T細(xì)胞亞型(Th17、Th1)的比例。與對照組相比,過繼輸注了感染Ad-IDO的BMDC組的小鼠其脾臟Th1比例明顯降低,而Th17處于極低水平,尚不能評價其在各組間的差異。受者淋巴結(jié)的T細(xì)胞亞群在不同組別間的差距并不明顯。 結(jié)論:以重組腺病毒為載體感染供者骨髓來源的樹突狀細(xì)胞,使其高表達(dá)IDO,可抑制不同品系來源的Th1和Th17的分化。之前的研究已經(jīng)證實,將其過繼輸注給受者并進(jìn)行皮膚移植,可以延長皮膚移植物的存活時間;在本研究中,通過檢測受者同種反應(yīng)性T細(xì)胞亞群的變化來進(jìn)一步探討了其機(jī)制。本研究成果提示,使供者骨髓來源樹突狀細(xì)胞高表達(dá)IDO,并過繼輸注可進(jìn)一步抑制同種移植物排斥反應(yīng),具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
[Abstract]:Objective: IDO expression vector for recombinant adenovirus (Ad-IDO) infection, donor bone marrow derived DC, the adoptive infusion to patients, to observe the high expression of IDO DC infusion on body skin transplantation T cell subsets in vitro. At the same time mixed lymphocyte culture in vitro, differentiation characteristics T lymphocyte subsets, to elucidate the IDO inhibitory response of T cells and protect the differentiation of allogeneic graft to provide experimental basis.
Methods: using 293T cells as packaging cells, amplification of recombinant Ad-IDO (E1, E3 deletion; gene E1; CMV promoter, SV40polyA signal). The amplified Ad-IDO infected donor bone marrow derived DC and allogeneic recipients from mouse spleen Na ve? T cells were co cultured with T cell culture system in detection of allogeneic subsets by flow cytometry (Th1, Th17) the proportion of Ad-IDO; transfection of donor bone marrow infusion of allogeneic DC recipients mice skin transplantation on recipients and recipients after transplantation in the spleen. Lymph node cells were detected by flow cytometry, to observe the subsets of T cell percentage change.
Results: 1. The recombinant adenovirus was amplified with 293T cells and identified.
In the continuous passage of 293T cells cultured in Ad-IDO and Ad control transfected cells showed obvious cytopathic effect; PCR showed that the recombinant adenovirus can still stable integration of IDO gene in multiple copies; Western blot results showed that the different passages of Ad-IDO infected 293T cells were able to make the stable expression of IDO protein.
Two, the effect of donor bone marrow DC on the differentiation of T cell subsets of the recipient with high expression of IDO
1, BMDC culture, adenovirus infection and expression of IDO
The BMDC from BALB/c mice was induced and cultured, and infected by adenovirus and Ad-IDO. After RT-PCR identification, BMDC infected with Ad-IDO had IDO mRNA expression. After Western Blot identification, the infected BMDC could effectively express the Western protein.
2, IDO and its metabolite L-Kyn inhibit the differentiation of homologous Th17 and Th1
The infected Ad-IDO BMDC and control group BMDC (BALB/c mouse source) C57BL/6 respectively with spleen derived T cells in mixed lymphocyte culture, and were analyzed by flow cytometry. BMDC and BMDC (Ad-control) group, BMDC (Ad-IDO) Th17 and Th1 were significantly reduced; while the establishment of the accession to the L-Kyn (the degradation of IDO metabolites of tryptophan) group, the Th17 and Th1 ratio were significantly decreased.
3, high expression of DC in the donor source IDO significantly inhibited the homoreactivity of Th1 but had no significant effect on Th17
The BALB/c mouse derived BMDC adoptive transfer to C57BL/6 mice, and the skin on the back of the transplant, to take the different time points after transplantation of spleen, lymph nodes, the detection of T cell subsets (Th17, Th1) ratio. Compared with the control group, the adoptive transfer of Ad-IDO infection in BMDC group the mice spleen Th1 ratio decreased significantly, while Th17 at a very low level, not in the evaluation of the differences among the groups. The lymph node of T cell subsets in different groups of the gap is not obvious.
Conclusion: the recombinant adenovirus infected donor bone marrow derived dendritic cells, the high expression of IDO can inhibit the differentiation of different strains from Th1 and Th17. Previous studies have confirmed that the adoptive transfer to recipients and skin transplantation can prolong skin graft survival; in this study, by detecting the recipients of allogeneic T cells subsets to further explore its mechanism. The results of this study suggest that donor bone marrow derived dendritic cells with high expression of IDO, and the adoptive infusion can further inhibit allograft rejection and potential clinical value.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1490870