本文關(guān)鍵詞： Vero細(xì)胞 放線菌素D 抗凋亡作用 單純皰疹病毒2型 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體 開放讀碼框1　出處：《華南理工大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：單純皰疹病毒Ⅱ型（Herpes Simplex Virus Ⅱ,HSV-2）具有易感染，容易傳播，難治愈的特點(diǎn)。它主要引起生殖器皰疹（genital herpes,GH）。初次感染HSV-2后，病毒會(huì)終身潛伏在人體的骶尾神經(jīng)節(jié)中。當(dāng)受到體內(nèi)外各種非特異性刺激時(shí)，病毒會(huì)被激活，造成復(fù)發(fā)感染，并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀。目前皰疹病毒潛伏及再激活的機(jī)制一直未明，是臨床上根治生殖器皰疹的難點(diǎn)所在。 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體是（Latency associated transcript,LAT）HSV-2在潛伏感染期間唯一大量表達(dá)的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。國(guó)外大量的研究表明，潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體在單純皰疹病毒潛伏及再激活過程中起著至關(guān)重要的作用。 目前有關(guān)LAT的作用假說很多，但具體是哪一種作用機(jī)制尚不明確。HSV-2起主要作用的LAT包含3個(gè)開放讀碼框（Open Reading Frame，ORF）。有研究表明單純皰疹病毒LAT可以通過讀碼框編碼蛋白的抗凋亡作用抑制宿主細(xì)胞的凋亡，維持病毒的潛伏感染狀態(tài)。 為此，本研究以HSV-2333基因組為模板PCR擴(kuò)增HSV-2LAT ORF1，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-ORF1。借助于xfect轉(zhuǎn)染試劑盒，轉(zhuǎn)染重組子，研究其在Vero細(xì)胞中的表達(dá)及其抗凋亡作用。 首先根據(jù)gene bank中的LAT ORFs序列設(shè)計(jì)引物，以HSV-2333基因組為模板PCR擴(kuò)增HSV-2LAT ORF1片段。PCR產(chǎn)物純化后同pEGFP-C2經(jīng)EcoRI、KpnI雙酶切后，用T4-ligase連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，kan+抗性篩選陽(yáng)性菌落，通過菌落PCR，雙酶切和測(cè)序?qū)λY選的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Vero細(xì)胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察HSV-2潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體LAT開放讀碼框ORF1融合綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。RT-PCR確認(rèn)ORF1mRNA在Vero細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)染48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的分布情況，顯微鏡下可見重組質(zhì)粒pEGFP-ORF1表達(dá)的綠色熒光主要集中在細(xì)胞核，大多數(shù)為圓形，形態(tài)規(guī)則，分布均勻。而空質(zhì)粒pEGFP-C2表達(dá)的綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，且不規(guī)則，與重組質(zhì)粒組相比較，熒光強(qiáng)度較弱。本研究用凋亡誘導(dǎo)劑放線菌素D(ActD)誘導(dǎo)各組細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡及Hochest3328熒光染色觀察凋亡誘導(dǎo)后各組細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。Gimesa染色觀察各組細(xì)胞細(xì)胞核的變化；發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-ORF1一組的細(xì)胞形態(tài)正常，與正常對(duì)照組細(xì)胞無(wú)差異。MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEGFP-ORF1的Vero細(xì)胞經(jīng)放線菌素D凋亡誘導(dǎo)后Vero細(xì)胞活性與未經(jīng)任何處理的正常對(duì)照組相比，，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，但高于放線菌素D誘導(dǎo)凋亡的Vero細(xì)胞組及與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C2且放線菌素D誘導(dǎo)凋亡的Vero細(xì)胞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。流式結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-ORF1且經(jīng)放線菌素D誘導(dǎo)凋亡組與正常對(duì)照組凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而顯著低于放線菌素D誘導(dǎo)凋亡組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C2且經(jīng)放線菌素D誘導(dǎo)凋亡組，差異顯著(P0.05)；caspase-3活性檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero細(xì)胞組caspase-3活性與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，而明顯低于空質(zhì)粒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 綜述以上研究結(jié)果表明，HSV-2LAT基因ORF1片段具有抗放線菌素D在Vero細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的功能。本實(shí)驗(yàn)研究為探究有關(guān)HSV-2LAT介導(dǎo)的病毒的潛伏和復(fù)發(fā)的機(jī)制打下一定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊慧蘭;白利利;;單純皰疹病毒2型潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體ORF2的表達(dá)及其抗凋亡作用[J];微生物學(xué)通報(bào);2010年03期

本文編號(hào)：1485892