本文關(guān)鍵詞： TLR9 LRR CpG DNA TNF-α NF-κB 蛋白結(jié)構(gòu) 原核表達(dá)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的: 細(xì)菌DNA是革蘭陽性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌共有的遺傳物質(zhì),是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)發(fā)生的主要致病因子之一,未甲基化的CpG序列即CpG基序(CpG motif)是細(xì)菌DNA免疫刺激的最小作用單位。Toll樣受體家族的TLR9(Toll-Like Receptor 9)是巨噬細(xì)胞識(shí)別CpG DNA的模式識(shí)別受體,它可通過激活單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),活化NF-κB、AP-1,從而大量釋放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等多種前炎癥細(xì)胞因子,引起急性炎癥反應(yīng)、SIRS甚至休克、死亡。 TLR9是跨膜蛋白質(zhì),分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。TLR9胞外區(qū)由25個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats,LRRs)組成,與識(shí)別CpG DNA有關(guān)。其中的LRR2、5、8、11序列后跟隨有插入氨基酸序列,可能是與CpG DNA的結(jié)合位點(diǎn)或參與結(jié)合CpG DNA。 但是,迄今為止,TLR9是如何識(shí)別CpG DNA、其識(shí)別位點(diǎn)在何處還不清楚,更不清楚TLR9識(shí)別CpG DNA的分子機(jī)制。因此,明確TLR9與CpG DNA的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)闡明CpG DNA介導(dǎo)炎癥的發(fā)生機(jī)制,并將其作為可能的新的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行疾病防治具有重要意義。 本課題深入分析TLR9胞外段與胞內(nèi)段空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性;應(yīng)用細(xì)菌生長抑制實(shí)驗(yàn)推測(cè)LRRs在識(shí)別CpG DNA中的作用;合成LRR多肽,觀察其與CpG DNA的親合力以及生物學(xué)活性;為明確TLR9與CpG DNA結(jié)合位點(diǎn)、闡明TLR9識(shí)別機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 一、TLR9胞外段與CpG DNA識(shí)別、結(jié)合LRR序列的確定 (一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大腸桿菌中的表達(dá)構(gòu)建含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的原核表達(dá)pET28系列載體,在大腸桿菌中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的蛋白。 (二)利用細(xì)菌生長變化推測(cè)TLR9胞外段與CpG DNA結(jié)合位點(diǎn) 含有TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列的pET28和pQE30原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)或M15感受態(tài),1 mM IPTG分別誘導(dǎo)8h,并在第0h、2h、4h、6h、8h分別取菌液測(cè)定細(xì)菌OD600,繪制生長曲線。 (三)應(yīng)用生物傳感器技術(shù)檢測(cè)LRR多肽與CpG DNA親和力 人工合成LRR2、5、8、11多肽,將生物素標(biāo)記的CpG DNA包被于生物素化樣品池,利用生物傳感器檢測(cè)各個(gè)LRR多肽與CpG DNA的親和力,結(jié)果以結(jié)合峰值表示。在此基礎(chǔ)上,測(cè)量、計(jì)算LRR多肽與CpG DNA的解離常數(shù)Kd值。 (四)應(yīng)用細(xì)胞因子釋放抑制實(shí)驗(yàn)觀察LRRs在結(jié)合CpG DNA中的作用 分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,加入48孔板中,每孔5×106個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)4h,預(yù)先準(zhǔn)備各LRR多肽與CpG DNA的混合物,加入培養(yǎng)孔內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)4h后取培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)TNF-α含量。 (五)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)化實(shí)驗(yàn)觀察LRRs對(duì)CpG DNA在細(xì)胞中聚集的影響 分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,加入24孔板中,在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同的6-FAM標(biāo)記的CpG DNA與LRR多肽的混合物后,培養(yǎng)1 h,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。 對(duì)各多肽進(jìn)行理論分析,計(jì)算多肽的各種理化參數(shù),如分子量、等電點(diǎn)、氨基酸構(gòu)成、原子組成等。 二、TLR9胞內(nèi)段抑菌作用的發(fā)現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究 (一) TLR9胞內(nèi)段CT序列在大腸桿菌中的表達(dá) 構(gòu)建含有TLR9跨膜段、胞內(nèi)段的pQE30-CT載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株,SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá),Wester-blot法進(jìn)一步確定目的蛋白的特異性。 (二) IPTG誘導(dǎo)對(duì)pQE30-CT轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長的影響 1. 1.0 mM IPTG誘導(dǎo)對(duì)pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌生長的影響擴(kuò)增pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌至OD600為0.3左右,1 mM IPTG分別誘導(dǎo)8h,并在第0h、2h、4h、6h、8h分別取菌液測(cè)定細(xì)菌OD600,繪制生長曲線。 2.不同濃度IPTG誘導(dǎo)對(duì)pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌生長的影響 3. pQE30-CT載體不同表達(dá)宿主菌的生長變化 4.不同起始誘導(dǎo)細(xì)菌濃度對(duì)IPTG誘導(dǎo)后生長的影響 5.含抗生素LB培養(yǎng)液對(duì)M15-pQE30-CT菌株誘導(dǎo)后生長的影響 分別使用了含雙抗(氨芐青霉素和卡那霉素)LB培養(yǎng)液和不含雙抗LB培養(yǎng)液,觀察M15-pQE30-CT菌株經(jīng)1.0 mM IPTG誘導(dǎo)后生長變化。 6. M15-pQE30-CT菌株IPTG誘導(dǎo)24 h生長曲線 7. M15-pQE30-CT誘導(dǎo)后超聲上清對(duì)大腸桿菌ATCC35218生長的影響 8. M15-pQE30-CT與大腸桿菌ATCC35218菌懸液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長變化 9. M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌形態(tài)變化 (三) IPTG誘導(dǎo)對(duì)含有不同區(qū)域片段pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌株生長的影響 將CT段進(jìn)行分解,共分成TM(跨膜段:810 aa～826 aa)、CD(胞內(nèi)段: 827 aa～1032 aa)、CT1(CT前1/2段:810 aa～923 aa)、CT2(CT中1/2段:861 aa～972 aa)以及CT3 (CT后1/2段:931 aa～1032 aa),分別構(gòu)建載體觀察轉(zhuǎn)化菌生長曲線。 結(jié)果: 一、TLR9胞外段與CpG DNA識(shí)別、結(jié)合LRR序列的確定 (一)TLR9胞外段LRR2、5、8、11序列在大腸桿菌中的表達(dá) pET28-LRR8轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有明顯目的蛋白表達(dá),而其它載體如pET28-LRR2、pET28-LRR5以及pET28-LRR11轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后未見相應(yīng)的蛋白條帶。 pET28-LRR2、pET28-LRR11轉(zhuǎn)化菌在IPTG誘導(dǎo)6 h后,與未誘導(dǎo)組相比細(xì)菌數(shù)量顯著減少,而轉(zhuǎn)化pET28-LRR8的細(xì)菌未見此現(xiàn)象。 (二)利用細(xì)菌生長變化推測(cè)TLR9胞外段與CpG DNA結(jié)合位點(diǎn) pET28a-LRR5轉(zhuǎn)化菌在IPTG誘導(dǎo)后生長曲線無明顯變化,而轉(zhuǎn)化有pET28a-LRR11、pET28a-LRR2、pET28a-LRR8的BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長明顯受到抑制。特別是pET28a-LRR11、pET28a-LRR2轉(zhuǎn)化菌,IPTG誘導(dǎo)后生長完全受到抑制。pQE30表達(dá)載體也出現(xiàn)類似結(jié)果。 (三)應(yīng)用生物傳感器技術(shù)檢測(cè)LRR多肽與CpG DNA親和力 在LRR2、LRR5、LRR8、LRR11這4個(gè)多肽中,LRR11與CpG DNA 2006的親和力最高,LRR8與CpG DNA 2006之間幾無親合力,LRR2和LRR5與CpG DNA 2006的親合力約為LRR11與CpG DNA 2006親合力的1/4～1/5,其中,LRR11多肽與CpG DNA的解離常數(shù)Kd值為13.2μM。 (四)應(yīng)用細(xì)胞因子釋放抑制實(shí)驗(yàn)觀察LRRs在結(jié)合CpG DNA中的作用 4個(gè)多肽片段提前與CpG DNA孵育后,LRR8幾乎沒有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的能力,而LRR11抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的能力最強(qiáng)。 (五)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)化實(shí)驗(yàn)觀察LRRs對(duì)CpG DNA在細(xì)胞中聚集的影響 LRR5、LRR8和LRR11能增加6-FAM CpG DNA在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,各組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度增加分別為27.3%、32.0%和69.2%。LRR11多肽能顯著6-FAM CpG DNA在細(xì)胞內(nèi)聚集,且呈明顯的量效關(guān)系。 對(duì)LRR11多肽的分析表明:LRR11多肽不含酸性氨基酸,有4個(gè)堿性氨基酸,等電點(diǎn)pI 11.10,增強(qiáng)CpG DNA在細(xì)胞內(nèi)聚集可能與其呈強(qiáng)堿性有關(guān)。 二、TLR9胞內(nèi)段抑菌作用的發(fā)現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究 (一) TLR9胞內(nèi)段CT序列在大腸桿菌中的表達(dá) 構(gòu)建了含有TLR9跨膜段、胞內(nèi)段的pQE30-CT載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株,經(jīng)Western-blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該載體菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能微量表達(dá)目的蛋白。另外,還發(fā)現(xiàn)重組菌在IPTG誘導(dǎo)4 h后,與未誘導(dǎo)組相比細(xì)菌數(shù)量顯著減少,推測(cè)表達(dá)的蛋白具有一定的抑菌活性。 (二) IPTG誘導(dǎo)對(duì)pQE30-CT轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長的影響 1. M15-pQE30-CT帶有TLR9的跨膜段和胞內(nèi)段TIR全序列,經(jīng)1 mM IPTG誘導(dǎo)后,在各個(gè)時(shí)間段細(xì)菌生長均受到非常顯著的抑制。 2. M15-pQE30-CT,經(jīng)0.1 mM、0.3 mM、1.0 mM、3.0 mM IPTG誘導(dǎo)后,在各個(gè)時(shí)間段細(xì)菌生長均受到非常顯著的抑制,不同濃度IPTG組細(xì)菌生長曲線幾乎完全重合,說明M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長受到抑制與IPTG的非特異作用無關(guān)。 3.將pQE30-CT轉(zhuǎn)化DH5α菌株,1 mM IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)后pQE30-CT DH5α轉(zhuǎn)化菌在各個(gè)時(shí)間段均受到明顯抑制,但是抑制作用不如M15轉(zhuǎn)化菌株,可能與DH5α并非pQE30系列載體最適表達(dá)宿主菌有關(guān)。 4.將M15-pQE30-CT菌株擴(kuò)增至OD值2.0時(shí)用1.0 mM IPTG誘導(dǎo)2 h,發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)組細(xì)菌OD值明顯下降,結(jié)果證實(shí)起始誘導(dǎo)細(xì)菌濃度不影響M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后生長抑制狀態(tài)。 5.在含有雙抗(氨芐青霉素和卡那霉素)和不含雙抗的LB培養(yǎng)液條件下,細(xì)菌誘導(dǎo)后生長均受到非常顯著抑制,排除抗生素對(duì)其的影響。 6.未誘導(dǎo)組細(xì)菌在第10 h達(dá)到生長平臺(tái)期,IPTG誘導(dǎo)組細(xì)菌在前10 h內(nèi)處于抑制狀態(tài),但從第10 h開始恢復(fù)生長,直至第20 h達(dá)到平臺(tái)期。 7. M15-pQE30-CT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲上清不影響大腸桿菌ATCC35218生長,說明:①M(fèi)15-pQE30-CT細(xì)菌誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)沒有“抑菌蛋白”;或者②M15-pQE30-CT細(xì)菌誘導(dǎo)后產(chǎn)生“抑菌蛋白”的量不夠多,收集后還不足以抑制ATCC35218生長。 8. M15-pQE30-CT和大腸桿菌ATCC35218不同比例菌懸液經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后,除了單獨(dú)M15-pQE30-CT組細(xì)菌生長受到抑制外,其余各組細(xì)菌生長無顯著差異。說明M15-pQE30-CT細(xì)菌誘導(dǎo)后不能釋放能抑制其它細(xì)菌生長的蛋白。 9.未誘導(dǎo)組M15-pQE30-CT細(xì)菌革蘭染色后,細(xì)胞形態(tài)清晰、完整,無聚團(tuán)現(xiàn)象,經(jīng)1.0 mM IPTG誘導(dǎo)2 h后,鏡下細(xì)胞數(shù)量顯著減少,細(xì)胞形態(tài)不完整、模糊。 (三) IPTG誘導(dǎo)對(duì)含有不同區(qū)域片段pQE30-CT載體轉(zhuǎn)化菌株生長的影響 共構(gòu)建了含有TM、CD、CT1、CT2、CT3片段的原核表達(dá)載體,觀察細(xì)菌生長曲線變化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化含有CT1段載體的細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌生長完全受到抑制,轉(zhuǎn)化含有CD段載體的細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌生長部分受到抑制,而IPTG誘導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)化含有TM、CT2、CT3段載體細(xì)菌的生長沒有影響。 結(jié)論: 1. TLR9胞外段LRR2、LRR5、LRR8、LRR11序列中,最有可能是CpG DNA結(jié)合位點(diǎn)的是LRR11序列,但不排除LRR2聯(lián)合參與的可能性。 1)原核表達(dá)LRR2、5、8、11蛋白,只有LRR8蛋白順利表達(dá),其它LRR未能正常表達(dá); 2)合成LRR2、5、8、11多肽,LRR11多肽與CpG DNA親合力最高; 3) LRR11多肽能抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α以及增強(qiáng)熒光標(biāo)記CpG DNA在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集。 2.構(gòu)建含有TLR9胞內(nèi)段的表達(dá)載體,表達(dá)的蛋白具有抑菌功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1481585