本文關(guān)鍵詞： CpG-ODN 多肽 細(xì)胞免疫 聚合酶鏈反應(yīng) MTT　出處：《廣東藥學(xué)院》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 通過將CpG-ODN和多肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),將活化后的PBMC與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng),對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行殺傷,評(píng)價(jià)并比較CpG-ODN和多肽的刺激PBMC的殺傷HepG2效應(yīng),研究CpG-ODN的免疫激活功能和初步機(jī)制;進(jìn)一步研究CpG-ODN和多肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激激活PBMC的作用機(jī)制,進(jìn)而探討CpG-ODN免疫激活功能的作用機(jī)制和CpG-OND刺激PBMC殺傷腫瘤的凋亡機(jī)制,初步探討多肽刺激激活PBMC殺傷HepG2的效果和機(jī)制。 方法 將還有CpG寡核苷酸序列的pUC18載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂布于氨芐平板37℃培養(yǎng),挑取陽性若干菌落于37℃小量液體培養(yǎng),試劑盒抽提質(zhì)粒,酶切電泳鑒定;將成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng),去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度法鑒定質(zhì)粒純度并計(jì)算含量。針對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn),設(shè)計(jì)針對(duì)甲胎蛋白的特異性抗原多肽,由公司合成特異性抗原多肽,多肽純度達(dá)到適合細(xì)胞試驗(yàn)水平。使用植物凝集素作為刺激PBMC增殖的陽性對(duì)照,使用多肽、CpG-ODN、乙肝表面抗原、pUC18質(zhì)粒作為刺激物作用于PBMC,MTT法檢測(cè)PBMC增殖效果,使用Excel統(tǒng)計(jì)作圖。設(shè)計(jì)合成針對(duì)TLR9通道的MyD88、TLR9、Hsp70的PCR引物,以β-actin作為對(duì)照,不同濃度CpG-ODN刺激PBMC,提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MyD88、TLR9、Hsp70的表達(dá)情況。使用多肽、CpG-ODN和多肽聯(lián)合CpG-ODN刺激PBMC后對(duì)HepG2進(jìn)行殺傷,MTT法檢測(cè)殺傷效果,使用Excel統(tǒng)計(jì)作圖。提取PBMC殺傷后的HepG2總RNA,反轉(zhuǎn)錄并使用Bcl-XL/S、ich3、Bid、Bcl-2為引物做聚合酶鏈反應(yīng),以β-actin作為對(duì)照,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)殺傷后HepG2的凋亡情況。 結(jié)果 CpG-ODN能有效刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖,刺激PBMC增殖較為穩(wěn)定,作為佐劑,與多肽聯(lián)用具有更好的刺激增殖作用,但作為核酸與蛋白質(zhì)相比,蛋白抗原的刺激增殖能力更強(qiáng);用不同劑量CpG-ODN刺激PBMC,在1μg/mL濃度時(shí),TLR9通道的mRNA轉(zhuǎn)錄活性較強(qiáng),0.1μg/mL和10μg/mL濃度mRNA轉(zhuǎn)錄活性低于1μg/mL濃度,抗凋亡因子Bcl-2的mRNA同樣在1μg/mL濃度有轉(zhuǎn)錄,但三個(gè)濃度Hsp70都無表達(dá)。在48h時(shí)間點(diǎn),經(jīng)CpG-ODN介導(dǎo)活化的PBMC對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的有很強(qiáng)的殺傷活性,其中CpG單用組的殺傷能力最高。在48h的殺傷能力明顯高于在72h的殺傷能力。CpG單用組、CpG聯(lián)合多肽組、多肽單用組、PBMC無刺激物對(duì)照組和HepG2組在72h檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上增殖活性均顯著高于48h檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上的增殖活性。PCR結(jié)果中,多肽和CpG-ODN聯(lián)用凋亡因子Bcl-XL和Bid都有表達(dá),單用多肽Bid也有表達(dá)。 結(jié)論:CpG-ODN和多肽能有效刺激發(fā)生PBMC增殖反應(yīng),CpG-ODN刺激PBMC細(xì)胞亞群較為廣泛,多肽刺激PBMC的細(xì)胞亞群具有一定的特異性。CpG-ODN刺激PBMC增殖效果穩(wěn)定,與蛋白質(zhì)或者多肽聯(lián)用刺激PBMC有一定的協(xié)同刺激作用。在合適濃度情況下,CpG-ODN刺激PBMC具有抗凋亡作用。CpG-ODN和多肽刺激PBMC后,PBMC殺傷HepG2能力增強(qiáng),設(shè)計(jì)合成的多肽能與淋巴細(xì)胞腫瘤表位結(jié)合,特異性激活T細(xì)胞,CpG-ODN聯(lián)合多肽刺激PBMC殺傷HepG2能力具有一定的協(xié)同效應(yīng)。
[Abstract]:Purpose The effects of CpG - ODN and polypeptide on the anti - tumor activity of PBMC induced by CpG - ODN and polypeptide were evaluated and compared . The mechanism of CpG - ODN and the action of CpG - ODN and CpG - ODN were further studied . method The recombinant plasmid of MyD88 , TLR9 and Hsp70 was designed and synthesized . Results CpG - ODN could stimulate the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells and stimulate PBMC to proliferate more stably . As an adjuvant , the expression of anti - apoptotic factor Bcl - 2 was higher than that at 48h . Conclusion : CpG - ODN and polypeptide can stimulate PBMC to proliferate . CpG - ODN can stimulate PBMC to have a certain specificity . CpG - ODN can stimulate PBMC proliferation . CpG - ODN can stimulate PBMC to have anti - apoptotic effect . CpG - ODN and polypeptide can stimulate PBMC to have anti - apoptotic effect .

【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 孟民杰;郭曉磊;戴帆;;多種屬CpG ODN誘導(dǎo)特異性抗體反應(yīng)的研究[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2007年03期

2 孟民杰;郭曉磊;葉f，

本文編號(hào)：1479583