本文關(guān)鍵詞： 冷暴露 大鼠 PI3K-Akt-mTOR通路 ATP 有絲分裂 雙核細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景 寒冷地區(qū)的冬季,人們?cè)趹敉饣顒?dòng)時(shí)會(huì)暴露于低溫環(huán)境中。從事低溫環(huán)境作業(yè)的人員和參加特殊環(huán)境軍事活動(dòng)的官兵也經(jīng)常暴露于低溫環(huán)境中。低溫環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響和如何預(yù)防低溫暴露相關(guān)疾病一直是人們研究的熱點(diǎn),具有重要意義。 低溫環(huán)境對(duì)人體造成損傷的機(jī)制以其特殊的軍事地位和作用,很少有相關(guān)內(nèi)容的公開報(bào)道。目前,人們對(duì)于低溫環(huán)境對(duì)機(jī)體損傷機(jī)制的研究多限于長(zhǎng)期的慢性暴露模型,而急性的低溫暴露模型尚未見到相關(guān)的報(bào)道。在北方高寒地區(qū)冬季,部隊(duì)執(zhí)行野外巡邏和站崗任務(wù)的士兵需要暴露在寒冷環(huán)境中,如果防護(hù)措施不當(dāng)則很容易造成急性凍傷。目前,對(duì)于急性寒冷損傷的研究多集中在體表皮膚及肌肉組織的凍傷,而體內(nèi)臟器在急性低溫暴露時(shí)受到的影響及其發(fā)揮的作用尚未見到相關(guān)報(bào)道。人體暴露于低溫環(huán)境后,需要?jiǎng)訂T產(chǎn)熱以維持體溫。雖然在此時(shí)肌肉的寒顫產(chǎn)熱占主導(dǎo)作用,但肝臟作為體內(nèi)最大的糖原儲(chǔ)存器官和靜息狀態(tài)的主要產(chǎn)熱器官,也可能參與到急性低溫暴露下機(jī)體的應(yīng)激過程中。在大鼠和人的正常生長(zhǎng)過程中,肝臟可以形成一定數(shù)量的雙核細(xì)胞,雙核細(xì)胞的形成可能與肝臟損傷和增殖能力相關(guān)。在能量缺乏或其他損傷效應(yīng)作用下,肝細(xì)胞有絲分裂失敗而形成雙核細(xì)胞。PI3K-Akt-mTOR通路是重要的生存信號(hào)通路,參與細(xì)胞的能量代謝,增殖分化,生長(zhǎng)繁殖等重要過程。其在低溫暴露過程中起到的作用已在慢性模型中進(jìn)行相關(guān)研究,但在急性低溫暴露模型中及在肝臟中的相關(guān)作用尚未闡明。 本研究試圖通過建立急性低溫暴露模型,探討急性低溫暴露是否可以引起肝臟病理生理學(xué)改變,并探討PI3K-Akt-mTOR通路是否參與了急性低溫暴露過程中的應(yīng)答過程及其調(diào)控機(jī)制,為探索更多的低溫暴露效應(yīng)標(biāo)志物及預(yù)防靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 研究目的 1.在大鼠急性低溫暴露模型中,研究急性低溫暴露引起大鼠肝臟的病理生理學(xué)改變,觀察肝臟有絲分裂細(xì)胞及雙核細(xì)胞在低溫暴露過程中數(shù)量的變化及細(xì)胞能量水平的變化。同時(shí)觀察PI3K-Akt-mTOR通路的變化情況及其與肝臟病理生理改變的關(guān)系。 2.通過使用通路抑制劑,觀察PI3K-Akt-mTOR通路與肝細(xì)胞能量水平變化的關(guān)系及其是否參與了肝細(xì)胞有絲分裂增加及雙核細(xì)胞形成的過程。 研究方法 1.利用低溫實(shí)驗(yàn)艙,建立大鼠急性低溫暴露模型:暴露溫度為㧟15℃,暴露時(shí)間為0.5 h、1 h、2 h和4 h。 2.利用組化方法,通過HE染色觀察急性低溫暴露后大鼠肝臟的損傷情況及雙核細(xì)胞的形成。 3.利用電鏡,觀察急性低溫暴露對(duì)大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響。 4.利用western blot方法,觀察PI3K-Akt-mTOR通路在急性低溫暴露中的變化情況。 研究結(jié)果 1.從HE染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),隨暴露時(shí)間延長(zhǎng),大鼠肝臟的損傷程度逐漸加深。在低溫暴露0.5 h即發(fā)生輕度肝細(xì)胞水腫,在低溫暴露4 h后,可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)變性、水腫,肝細(xì)胞有絲分裂增加并且出現(xiàn)大量雙核細(xì)胞和少數(shù)凋亡細(xì)胞。從電鏡結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),低溫暴露0.5 h可導(dǎo)致肝細(xì)胞糖原減少,線粒體輕度腫脹;低溫暴露4 h可致肝細(xì)胞內(nèi)糖原耗竭,線粒體明顯腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被壓縮,包繞于線粒體周圍。 2.通過對(duì)肝細(xì)胞ATP含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在低溫暴露0.5 h,肝細(xì)胞ATP含量明顯增加,并隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低(p0.05)。 3. western blot的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt-mTOR通路相關(guān)蛋白出現(xiàn)先升高后降低的一過性激活, Akt蛋白的Ser-473位點(diǎn)、Thr-308位點(diǎn);mTOR蛋白的Ser-2448位點(diǎn)、Ser-2481位點(diǎn)和p70 S6K蛋白的Thr-389位點(diǎn)在低溫暴露0.5 h的磷酸化程度明顯升高,隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。在對(duì)線粒體蛋白的測(cè)定發(fā)現(xiàn),Akt蛋白和mTOR蛋白在線粒體內(nèi)的表達(dá)與其在胞質(zhì)中的表達(dá)趨勢(shì)一致。另外,與能量相關(guān)的AMPK蛋白的Thr-172位點(diǎn)隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而磷酸化程度逐漸增加。 4.為進(jìn)一步證實(shí)急性低溫暴露可以誘導(dǎo)大鼠肝臟有絲分裂增加及雙核細(xì)胞形成增加,利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)大鼠肝臟雙核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫暴露4 h后,大鼠肝臟有絲分裂期細(xì)胞數(shù)量明顯增加,并且雙核細(xì)胞數(shù)量明顯增加(p0.05)。 5.通過腹腔注射抑制劑渥曼青霉素(wortmannin),可以發(fā)現(xiàn)低溫暴露4 h大鼠的肝臟細(xì)胞ATP水平與非抑制劑處理組相比明顯降低,與室溫對(duì)照組相比明顯升高(p0.05)。大鼠肝臟有絲分裂期細(xì)胞所占比例無明顯改變,雙核細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(p0.05)。 研究結(jié)論 1.急性低溫暴露4 h可以引起大鼠肝臟損傷,引起肝細(xì)胞ATP水平的異常增加,誘導(dǎo)靜息期肝細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期并伴隨大量雙核細(xì)胞形成。 2. PI3K-Akt-mTOR通路參與了急性低溫暴露對(duì)大鼠肝臟的損傷作用,參與了低溫暴露過程中ATP的生成調(diào)節(jié)并促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂及雙核細(xì)胞的形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1466320