本文關(guān)鍵詞： 單克隆抗體 結(jié)構(gòu)確證 糖鏈 功能研究　出處：《中國藥品生物制品檢定所》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 單抗藥物是近年來復(fù)合增長率最快的一類生物技術(shù)藥物,全球年銷售額從1997年的3.10億美元上升到2004年的103億美元,并預(yù)測2010年將達(dá)到303億美元;其在生物制藥產(chǎn)業(yè)中所占份額也從2000年的1/5上升到2004年的1/4,并將在2010年達(dá)到1/3,單抗藥物具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。 為保證單抗藥物的用藥安全,必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。單抗藥品與重組細(xì)胞因子類藥物不同,其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、容易發(fā)生翻譯后修飾,質(zhì)量研究相對復(fù)雜,研究建立與之適應(yīng)的質(zhì)量控制方法尤為必要和重要。針對此問題,本論文選擇一種具有代表性的重組嵌合抗CD20單抗作為研究對象,對其一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證,并就單抗所含糖鏈對其結(jié)構(gòu)與功能的影響進(jìn)行了初步研究。 論文第一部分對單抗的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。首先用液質(zhì)聯(lián)用的方法測定了單抗輕、重鏈的精確分子量,相對誤差均小于0.01%。通過分別測定脫糖前后單抗重鏈的分子量確定其糖鏈類型為巖藻糖化的雙觸角復(fù)雜型N-糖,糖鏈存在不均一性,非還原端未發(fā)生唾液酸化,糖含量介于2.0%與2.4%之間。單抗N-末端存在焦谷氨酸封閉,對其進(jìn)行焦谷氨肽酶酶解后用Edman降解法測定了其N-末端氨基酸序列,測定結(jié)果與理論值一致。通過繪制單抗的質(zhì)量肽圖確證了單抗的氨基酸序列(氨基酸覆蓋率97%)、鑒定了其糖基化位點(Asn301)、并確證了其中10對鏈內(nèi)二硫鍵的配對方式。 第二部分分析了糖鏈對單抗結(jié)構(gòu)的影響,主要是對單抗鉸鏈區(qū)空間結(jié)構(gòu)及其二級結(jié)構(gòu)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)去除糖鏈后單抗鉸鏈區(qū)的木瓜蛋白酶酶切位點發(fā)生變化,說明糖鏈的切除對單抗鉸鏈區(qū)的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。圓二色譜測定結(jié)果顯示:糖鏈切除前后單抗的圓二色譜不一致,說明糖鏈的切除對單抗的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。 第三部分分析了糖鏈對單抗生物學(xué)功能的影響,主要是對抗體CDC活性的影響。測定結(jié)果顯示去除糖鏈后單抗的CDC活性基本消失,說明糖鏈對其十分重要。該活性的產(chǎn)生主要涉及2種蛋白間的相互作用:抗體與細(xì)胞表面CD20抗原的結(jié)合以及補體與抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合,并進(jìn)一步設(shè)計實驗對糖鏈影響單抗CDC活性的機制進(jìn)行了研究。 應(yīng)用競爭法測定了糖鏈切除前后抗體與CD20抗原的結(jié)合能力,結(jié)果顯示糖鏈切除后抗原抗體結(jié)合能力下降約40%,說明糖鏈切除影響抗體與抗原的結(jié)合并進(jìn)一步影響抗體的CDC活性。應(yīng)用BIAcore直接測定抗體與補體的結(jié)合能力,結(jié)果顯示抗體與補體未發(fā)生明顯的相互作用,原因為游離抗體的補體結(jié)合位點未暴露,不能與補體結(jié)合。 綜上所述,本課題對單抗的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的確證,建立并完善了一系列單抗結(jié)構(gòu)分析方法,可為重組單抗制品的質(zhì)量控制提供參考;另一方面,通過分析單抗所含糖鏈對其結(jié)構(gòu)與功能的影響揭示了糖鏈的重要性,為重組糖蛋白類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。
[Abstract]:Monoclonal antibody drugs are a class of biotech drugs combined the fastest growth rate in recent years, the global annual sales rose from $310 million in 1997 to $10 billion 300 million in 2004, and forecast in 2010 will reach $30 billion 300 million; its share rose from 1/5 in 2000 to 1/4 in 2004 in the biopharmaceutical industry, and will reach in 2010 1/3, monoclonal antibody drugs has great economic value and social value.
In order to ensure the safety of monoclonal antibody drugs, must carry on the strict quality control of the drug and recombinant cytokines. Monoclonal antibody drugs are different, their high molecular weight, complex structure, easy occurrence of post-translational modifications, quality research is relatively complex, the research establishment and to adapt the quality control method is particularly necessary and important. In order to solve this problem. This paper selects a representative of recombinant chimeric anti CD20 monoclonal antibody as the research object, the basic structure was confirmed, and the effect of sugar chain mAb on its structure and functions were studied.
In the first part of the monoclonal antibody level structure were confirmed. The first method with liquid chromatography-mass spectrometry determination of monoclonal antibody light, accurate molecular weight of the heavy chain, the relative error is less than 0.01%. by determined the sugar chain type fucosylated biantennary complex type N- sugar sugar after the molecular weight of the heavy chain and monoclonal antibody respectively, the heterogeneity of the sugar chain, non reducing end did not occur between sialic acid, sugar content is between 2% and 2.4%. The mAb N- terminal pyroglutamic acid closed the pyroglutamate aminopeptidase after enzymatic hydrolysis by Edman degradation method of the N- terminal amino acid sequence was determined. The determination results are consistent with the theoretical value of the. The quality of rendering monoclonal antibody peptide mapping confirmed the amino acid sequence of monoclonal antibodies (amino acid coverage rate of 97%), the glycosylation sites were identified (Asn301), and confirmed 10 of them in the chain of two disulfide pairing.
The second part analyzes the influence on the structure of sugar chain monoclonal antibody, is the main influence on the spatial structure and the hinge region of mAb two level structure. The experimental results showed that the removal of the sugar chain after papain mAb hinge cutting site changes, suggest that excision of sugar chain against hinge region spatial structure influence. The determination results round two: sugar chain chromatography showed that monoclonal antibody before and after excision of round two was not consistent, that of the sugar chain resection of mAb two level structure of impact.
The third part analyzes the influence on the biological function of sugar chain monoclonal antibody, is the main influence on the activity of CDC antibody were measured. The results show that the removal of the sugar chain after mAb CDC activity disappeared, that it is very important to the sugar chain. The activity produced mainly involve 2 types of protein-protein interactions: a combination of antibody and cell surface CD20 antigen and complement and antigen antibody complexes, and further design experiments on the sugar chain CDC antibody activity mechanism was studied.
Binding capacity of sugar chain before and after excision of antibody and CD20 antigen was determined by competition law, results showed that the sugar chain after removal of antigen antibody binding capacity decreased by about 40%, indicating the removal of oligosaccharides combined influence of antibody and antigen antibody and further affect the activity of CDC. Combined with the ability of direct determination of antibody and complement of BIAcore applications, and the results showed that the antibody complement without obvious interactions, due to the free antibody complement binding sites is not exposed, and complement fixation.
To sum up, the primary structure of the monoclonal antibody in detail were established and improved analysis method of a series of monoclonal antibody structure, provide reference for quality control of recombinant monoclonal antibody products; on the other hand, through the analysis of monoclonal antibody of sugar chain on the structure and function of the influence and reveals the importance of the sugar chain. It provides a basis for recombinant glycoproteins drug quality standard.

【學(xué)位授予單位】：中國藥品生物制品檢定所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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