本文關(guān)鍵詞： H5N1流感疫苗 反向遺傳學(xué) Vero細(xì)胞　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 流行性感冒是由流感病毒引起的一種損害呼吸系統(tǒng)為主的疾病,在世界范圍內(nèi)流行,是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要傳染病之一。20世紀(jì)曾爆發(fā)過(guò)3次全球性的人間流感大流行,分別由H1N1、H2N2、H3N2亞型流感病毒引起,尤其在1918年爆發(fā)的‘西班牙流感’造成2000多萬(wàn)人死亡,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展。近年,高致病性H5N1人禽流感時(shí)有發(fā)生,自1997年香港首次報(bào)道人感染H5N1高致病性禽流感病毒以來(lái),已經(jīng)波及全球很多國(guó)家及地區(qū)。截止2009年6月2日人禽流感確診病例433人,死亡262人,死亡率高達(dá)60%以上,對(duì)人類(lèi)健康的危害日益嚴(yán)重。因此WHO要求世界各國(guó)做好應(yīng)對(duì)流感大流行的防控準(zhǔn)備。 接種疫苗是防控禽流感的有效手段。目前生產(chǎn)人用高致病性禽流感疫苗的基質(zhì)主要是雞胚,然而其存有如下問(wèn)題:疫苗株的生產(chǎn)周期長(zhǎng),缺乏高質(zhì)量的雞胚供應(yīng),一旦流感爆發(fā)其來(lái)源將成為瓶頸,無(wú)法及時(shí)應(yīng)對(duì)流感疫情。因此,開(kāi)展人用禽流感疫苗的生產(chǎn)介質(zhì)研究成為防控高致病性禽流感的重大課題。細(xì)胞是生產(chǎn)疫苗的優(yōu)良介質(zhì),目前,獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用流感疫苗的細(xì)胞系有兩種:Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞。其中Vero細(xì)胞在全球獲得批準(zhǔn)使用,MDCK細(xì)胞在歐洲獲得批準(zhǔn)。然而,流感病毒在Vero細(xì)胞中存在低復(fù)制、低適應(yīng)性問(wèn)題,因此,開(kāi)展Vero細(xì)胞高適應(yīng)性的研究成為亟需解決的課題。 流感反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展為獲得疫苗株提供了強(qiáng)有力的工具,而制備高致病性H5N1人用禽流感疫苗的首要環(huán)節(jié)就是獲得疫苗株。與以往在雞胚中共感染病毒,再通過(guò)篩選獲得所需要的重配株相比,使用反向遺傳學(xué)技術(shù)來(lái)制備流感疫苗株的方法更直接合理,并大大縮短了產(chǎn)生目的疫苗株的時(shí)間,為應(yīng)對(duì)人禽流感病毒的大流行贏得了時(shí)間。流感病毒NS基因(非結(jié)構(gòu)基因)包括NS1和NS2兩個(gè)片段,分別編碼NS1蛋白與NS2蛋白。研究顯示NS1蛋白對(duì)于病毒RNA的翻譯及復(fù)制起重要作用。而NS2蛋白可與核蛋白相互作用并可介導(dǎo)病毒核糖核蛋白的輸出,并且NS2蛋白的核輸出信號(hào)基序?qū)τ跍p毒活疫苗的生產(chǎn)起至關(guān)重要的作用,這說(shuō)明流感病毒NS基因?qū)τ诓《镜膹?fù)制起關(guān)鍵作用。 WHO推薦使用Vero細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)人用疫苗產(chǎn)品,而研究發(fā)現(xiàn)流感病毒不能在Vero細(xì)胞中高滴度復(fù)制。為了實(shí)現(xiàn)由Vero細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的目的,我們采取兩條途徑:一方面從流感病毒本身著手,修飾流感NS基因?yàn)閂ero細(xì)胞高適應(yīng)型,利用反向遺傳學(xué)方法產(chǎn)生重組疫苗株,使其具有Vero細(xì)胞高生長(zhǎng)表型;另一方面,對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行改造篩選,獲得對(duì)禽流感病毒較敏感的細(xì)胞株,通過(guò)這兩條途徑為使用Vero細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗,快速生產(chǎn)安全有效的疫苗奠定了基礎(chǔ)。為將來(lái)能夠及時(shí)預(yù)防流感爆發(fā)提供了技術(shù)保證,因此意義重大。 本課題的研究目標(biāo)是基于Vero細(xì)胞利用反向遺傳學(xué)方法產(chǎn)生能在Vero細(xì)胞中高產(chǎn)量增殖的流感疫苗株,即從流感NS基因出發(fā),對(duì)其進(jìn)行基因突變,使其修飾為Vero細(xì)胞適應(yīng)型,HA與NA來(lái)自于致弱的H5N1人禽流感疫苗株,剩余基因片段來(lái)源于PR8,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)采用1+2+5的病毒重組模式產(chǎn)生Vero細(xì)胞高適應(yīng)的人用H5N1流感疫苗株,為Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究主要包括以下三部分: 1、Vero細(xì)胞高產(chǎn)H5N1流感病毒疫苗株的拯救:首先,根據(jù)Hoffmann等發(fā)表的特異性引物序列通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增疫苗株重配H5N1-A/Anhui/01/2005的HA、NA基因并測(cè)序驗(yàn)證;其次,修飾PR8病毒的NS基因?yàn)閂ero適應(yīng)型,分別在NS1基因21、58、60、127、174、189位氨基酸定點(diǎn)突變,并在231-238位缺失,在NS2基因16、31、86、107位氨基酸定點(diǎn)突變,并在231-238位缺失,合成NS基因片段。分別構(gòu)建質(zhì)粒pHW2000-HA(A)、pHW2000-NA(A);pHW2000-NS,測(cè)序驗(yàn)證正確,分別以7+1模式共轉(zhuǎn)染分別驗(yàn)證其能否正常工作。最后,以構(gòu)建好的質(zhì)粒與PR8拯救體系的其它5個(gè)內(nèi)部基因做為骨架,按1+2+5模式共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞拯救H5N1流感病毒疫苗株,并通過(guò)檢測(cè)其基因組序列確定為所需目的病毒株,電鏡觀察顯示符合流感病毒典型形態(tài)特征,初步顯示病毒拯救成功。 2、拯救病毒株的生物學(xué)特性的初步鑒定:拯救的病毒株含有疫苗株重配H5N1-A/Anhui/01/2005的HA、NA基因,通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)鑒定其型別為H5N1亞型;另外,拯救的流感病毒株含有修飾的NS基因,這對(duì)其復(fù)制特性產(chǎn)生重要影響。在TPCK-胰酶存在的情況下,將等量拯救病毒株與其母本株分別接種于Vero細(xì)胞單層,置于37℃、5%CO2孵箱孵育,鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)情況,記錄病變時(shí)間,初步顯示拯救病毒株出現(xiàn)完全CPE的半數(shù)時(shí)間短于其母本株(18h,25h);此外,對(duì)兩株疫苗株在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明修飾NS基因改善了拯救疫苗株在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性,顯示出其在Vero細(xì)胞中的高生長(zhǎng)表型。任何疫苗株生物學(xué)特征的改善均需保證其抗原性的穩(wěn)定,我們將疫苗株在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代10次,分別隨機(jī)檢測(cè)細(xì)胞上清液中病毒的HA、NA、NS基因序列,結(jié)果顯示同源性均在99.9%以上,說(shuō)明拯救的疫苗株在Vero細(xì)胞傳代中沒(méi)有發(fā)生抗原改變,這為疫苗的生產(chǎn)提供了保證。 3、拯救的Vero細(xì)胞高適應(yīng)性H5N1疫苗株安全性及免疫原性檢測(cè):將拯救的疫苗株在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增,收獲細(xì)胞上清液,并經(jīng)蔗糖密度梯度離心法濃縮純化病毒。使用雞胚半數(shù)感染劑量(EID50)與半數(shù)組織感染劑量(TCID50)測(cè)定純化后的病毒量。SDS-PAGE電泳鑒定拯救的疫苗株含有流感病毒的主要抗原成分。在雞胚與小鼠模型中對(duì)其致病性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示拯救的疫苗株均不具有致死性,說(shuō)明其安全。在上述基礎(chǔ)上對(duì)拯救疫苗株的免疫原性檢測(cè),將經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化的重配H5N1-A/Anhui/01/2005-NS病毒制成滅活疫苗,以Al(OH)3為佐劑,終濃度為1.6mg/ml。按相同劑量(HA,15μg)肌肉接種8周齡雌性Balb/C小鼠,第一次免疫后14天加強(qiáng)免疫1次,分別在第7、14、21、28天小鼠尾靜脈采血檢測(cè)血清IgG滴度以及HI滴度。結(jié)果顯示與母本株有相似的免疫原性。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)利用反向遺傳學(xué)方法由Vero細(xì)胞拯救產(chǎn)生了人用H5N1亞型高致病性禽流感疫苗株——重配H5N1-A/Anhui/01/2005-NS,縮寫(xiě)為rgAnhui/NS。拯救的疫苗株含有修飾的NS基因,并且在Vero細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞病變的時(shí)間明顯縮短,生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)也有改善,這說(shuō)明拯救的H5N1亞型流感疫苗株具有Vero細(xì)胞高適應(yīng)表型,為應(yīng)用Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗提供了原始數(shù)據(jù);另外,拯救的疫苗株含有流行株安徽株的表面抗原基因,型別鑒定為H5N1亞型,符合拯救病毒的預(yù)期型別;在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代測(cè)定其表面抗原HA、NA的基因序列,未發(fā)現(xiàn)改變,表明其抗原保持穩(wěn)定;分別在雞胚與小鼠模型中對(duì)其致病性進(jìn)行鑒定,未發(fā)現(xiàn)致死性現(xiàn)象,表明拯救的疫苗株安全;小鼠免疫原性檢測(cè)表明拯救的疫苗株能夠誘導(dǎo)有效地免疫反應(yīng),并且與母本株相比激發(fā)的抗體滴度沒(méi)有明顯差別。這些結(jié)果為發(fā)展細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗提供了保證。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1451766