本文關(guān)鍵詞： Nkx2-5 同源盒轉(zhuǎn)錄因子 pEGFP-N1-Nkx2-5 P19細(xì)胞 心肌分化 基因轉(zhuǎn)染 5-氮胞苷　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:哺乳動(dòng)物成熟個(gè)體中的心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞,受到損傷時(shí)一般由瘢痕進(jìn)行替代修復(fù),由此造成的心肌細(xì)胞缺失和數(shù)量下降是導(dǎo)致心臟收縮功能下降,進(jìn)而引起心力衰竭等心臟疾病的重要原因。近年來的研究表明,成體心臟中的心肌干細(xì)胞數(shù)量極少,不能對(duì)受損的心肌起到修復(fù)作用,加上心臟移植療法的供體、免疫原性和費(fèi)用的限制,現(xiàn)在眾多研究者把目光投向細(xì)胞移植治療取代壞死的心肌細(xì)胞、增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、新生心肌細(xì)胞甚至骨骼肌細(xì)胞都可以在一定程度上改善心功能,但是細(xì)胞移植的研究還有很多亟待解決的難題,首要難題之一就是上述用于移植的細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率太低,得不到移植所需的大量有收縮功能的心肌細(xì)胞。因此探索在心肌分化過程中的具體機(jī)制將具有重要意義,許多研究者推測(cè)心肌分化的過程始于某個(gè)或某些關(guān)鍵基因的啟動(dòng),通常這些基因的蛋白產(chǎn)物都是轉(zhuǎn)錄因子,它們可以使下游的靶基因呈級(jí)聯(lián)式地激活,直至分化完成。 同源盒基因Nkx2-5又稱為心臟特異性同源盒基因(cardiac specific homeobox, Csx),是所有脊椎動(dòng)物心臟發(fā)生中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一,也是目前研究最多的與心臟發(fā)育和心肌分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子之一,與早期研究發(fā)現(xiàn)的、決定果蠅心臟發(fā)育的tinman基因?yàn)橥椿?Nkx2-5屬于NK2型同源盒基因家族成員。該基因在復(fù)雜的心臟發(fā)育程序中起重要調(diào)控作用,許多研究表明Nkx2-5的表達(dá)對(duì)于胚胎心肌細(xì)胞的形成極為重要。在非洲蟾蜍胚胎,過表達(dá)Nkx2-5可以導(dǎo)致由心肌數(shù)目增多引起的心臟增大。注射Nkx2-5到斑馬魚的胚胎導(dǎo)致心肌數(shù)目增多,心臟增大,將表達(dá)Nkx2-5的細(xì)胞移植至生心區(qū)以外的組織可引發(fā)心臟標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。國外也有報(bào)道Nkx2-5的表達(dá)可促進(jìn)P19細(xì)胞和P19CL6細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,提高心特異基因的表達(dá),且保護(hù)心肌免受脅迫引起的損害。研究證實(shí),Nkx2-5基因調(diào)控心納素、心臟α-actin,心錨蛋白重復(fù)序列蛋白、A1腺甙受體、鈣網(wǎng)織蛋白、間隙連接蛋白40等基因的表達(dá)。這些目的基因編碼重要的結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控心肌特性,說明Nkx2-5有轉(zhuǎn)錄調(diào)控心肌程序的功能。但Nkx2-5的表達(dá)能否使哺乳類干細(xì)胞產(chǎn)生有收縮功能的心肌細(xì)胞以及使非心肌細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞仍有不同爭議。而且國內(nèi)關(guān)于Nkx2-5在心肌分化中作用的相關(guān)報(bào)道少而又少,因此本研究擬做該方面的研究。 P19胚胎癌細(xì)胞(embryonal carcinoma cells, EC)是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中誘導(dǎo)形成的EC細(xì)胞系,體外培養(yǎng)經(jīng)多次傳代仍保持胚胎干細(xì)胞的特性。P19細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可分化為包括心肌在內(nèi)的多種細(xì)胞,在P19細(xì)胞向心肌分化的過程中,其細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及電生理特性與正常小鼠心肌發(fā)育過程相似,且該細(xì)胞易于進(jìn)行基因操作,是研究心肌細(xì)胞發(fā)育的良好體外模型。 因此,本課題擬將Nkx2-5基因轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞,并篩選出穩(wěn)定表達(dá)Nkx2-5的P19細(xì)胞,觀察其在沒有誘導(dǎo)劑的情況下向心肌分化的情況。并研究在5-氮胞苷(5-azacytidine, 5-aza)的作用下,穩(wěn)定表達(dá)Nkx2-5的P19細(xì)胞在單層培養(yǎng)時(shí)向心肌分化的情況,以闡明心肌細(xì)胞分化過程中的一些規(guī)律,為各種干細(xì)胞有效轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞提供策略。 方法: 1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定由日本Hiroshi Akazawa博士惠贈(zèng)的pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒,經(jīng)常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,擴(kuò)增提取之后經(jīng)XbaI,HindⅢ雙酶切鑒定。以pEFSA-HA-Nkx質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增Nkx2-5基因全長,瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收靶片斷。再以擴(kuò)增的Nkx2-5基因全長為模板,PCR擴(kuò)增Nkx2-5基因編碼框,瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收靶片斷。PCR擴(kuò)增的Nkx2-5基因編碼框和載體pEGFP-N1分別經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切過夜,分別回收后將二者連接,置16℃恒溫過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上,37℃倒置培養(yǎng)16～24 h;挑取單個(gè)陽性菌落,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行菌落PCR鑒定有無目的片段,再經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切鑒定,同時(shí)將構(gòu)建質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)公司測(cè)序。 2外源表達(dá)Nkx2-5誘導(dǎo)聚集P19細(xì)胞向心肌分化 實(shí)驗(yàn)分轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染之前通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的細(xì)胞接種密度,轉(zhuǎn)染最佳體系,G418篩選濃度。本實(shí)驗(yàn)采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞,轉(zhuǎn)染之后24h將細(xì)胞1:10比例傳代,G418穩(wěn)定篩選兩周后,將篩出細(xì)胞聚集培養(yǎng)四天形成聚集體,聚集體移入培養(yǎng)皿中貼壁生長。在貼壁的4天、8天、12天、16天取細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)desmin、α-sarcomeric actin和cTnT的表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)α-sarcomeric actin和cTnT的共表達(dá);RT-PCR檢測(cè)GATA-4、α-MHC、ANP基因的表達(dá);Western blot檢測(cè)α-sarcomeric actin和cTnT蛋白的表達(dá)。并取貼壁16天的細(xì)胞透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。未轉(zhuǎn)染組將P19細(xì)胞直接聚集培養(yǎng),觀察分化的情況,未轉(zhuǎn)染組檢測(cè)指標(biāo)和取材時(shí)間同轉(zhuǎn)染組。 3 5-氮胞苷誘導(dǎo)外源表達(dá)Nkx2-5的P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)向心肌分化 實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組為5-aza誘導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)Nkx2-5基因的單層培養(yǎng)P19細(xì)胞,對(duì)照組為5-aza誘導(dǎo)的單層培養(yǎng)P19細(xì)胞。用1μmol/L的5-aza濃度分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的4天、8天、12天、16天取細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)α-sarcomeric actin和cTnT的表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)α-sarcomeric actin和cTnT的共表達(dá);RT-PCR檢測(cè)GATA-4、α-MHC和ANP基因的表達(dá);Western blot檢測(cè)α-sarcomeric actin和cTnT的蛋白表達(dá);并取實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)16天的細(xì)胞透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果: 1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定 pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒經(jīng)XbaI,HindⅢ雙酶切鑒定含有約1500bp的基因片段,與人Nkx2-5基因全長(1585bp)大小一致,所以pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒確含有人Nkx2-5基因全長。以pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒為模板,第一次擴(kuò)增出約1500bp的基因片段,與人Nkx2-5基因全長大小一致;以基因全長為模板,第二次擴(kuò)增出約1000bp的基因片段,與人Nkx2-5基因編碼框(974bp)大小一致。酶切Nkx2-5基因的編碼框及克隆用載體pEGFP-N1分別得到帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的基因片段(約900bp)和載體(4.7kb),分別回收連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后,篩出新生菌落PCR顯示可以擴(kuò)增出大小約1000bp的目的條帶,抽提重組質(zhì)粒,經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切之后,可獲得約1000bp和4.7kb的條帶。用啟動(dòng)子CMV引物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)與Gene Bank查詢的人Nkx2-5基因編碼框比對(duì),98%一致。且基因起始端Kozak序列完全,基因終止子已經(jīng)突變、讀碼框正確。確定在本研究中,pEGFP-N1-Nkx2-5重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2外源表達(dá)Nkx2-5誘導(dǎo)聚集P19細(xì)胞向心肌分化 實(shí)驗(yàn)確定,轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代密度:2×105/ml;轉(zhuǎn)染的最佳體系:采用質(zhì)粒DNA(μg)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μl) 1:3的比率;G418穩(wěn)定篩選濃度:700μg/ml。轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5之后的24h可見部分P19細(xì)胞表達(dá)Nkx2-5-EGFP融合蛋白,700μg/ml G418篩選14天后,大多數(shù)細(xì)胞具有綠色熒光,這些細(xì)胞為外源表達(dá)Nkx2-5的P19細(xì)胞。轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞聚集培養(yǎng)4天形成聚集體,聚集體貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞由周邊爬出形成生長暈,暈中細(xì)胞胞體變大變長,伸出突起、彼此相連。在轉(zhuǎn)染組,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:Desmin、α-sarcomeric actin和cTnT三種抗體4天的時(shí)候都沒有表達(dá),8天、12天、16天時(shí)三種抗體均有表達(dá),呈逐漸增高的趨勢(shì)。12天、16天的細(xì)胞中有明顯棕黃色成束樣結(jié)構(gòu)。Desmin在16天、12天的表達(dá)量與8天比有顯著差異(P0.01);α-sarcomeric actin在16天的表達(dá)量與8天比有顯著差異(P0.01);cTnT的表達(dá)16天與8天比有顯著差異(P0.01)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示α-sarcomeric actin和cTnT兩種抗體在貼壁培養(yǎng)的8天、12天、16天時(shí)共表達(dá),且表達(dá)量呈逐漸增高趨勢(shì),兩種蛋白在同一細(xì)胞相同部位重疊表達(dá)。RT-PCR分析結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組GATA-4在貼壁培養(yǎng)的4天有表達(dá),8天、12天表達(dá)逐漸增多,16天時(shí)表達(dá)有所下降。α-MHC和ANP在貼壁培養(yǎng)的8天有表達(dá),12天和16天時(shí)表達(dá)逐漸增多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明GATA-4表達(dá)量8天、12天、16天與4天比有顯著差異(P0.05或P0.01),α-MHC在12天、16天的表達(dá)量與8天比有顯著差異(P0.05,P0.01),ANP在16天的表達(dá)量與8天比有顯著差異(P0.01),16天表達(dá)量與12天比也有顯著差異(P0.01);Western Blot結(jié)果顯示:兩種蛋白都是在8天的時(shí)候有表達(dá),12天和16天時(shí)表達(dá)量逐漸增高,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示12天、16天時(shí)α-sarcomeric actin的表達(dá)量與8天相比有顯著差異(P0.01),16天的表達(dá)量與12天相比也有顯著差異(P0.01)。cTnT 12天、16天的表達(dá)量與8天相比有顯著差異(P0.01),16天的表達(dá)量與12天相比,也有顯著差異(P0.01)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞經(jīng)聚集、貼壁培養(yǎng)16天后,部分細(xì)胞胞體呈長柱形,相鄰細(xì)胞間互相連接在一起,而且出現(xiàn)特化的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu),連接的兩側(cè)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微絲樣結(jié)構(gòu)。部分細(xì)胞的胞質(zhì)中,出現(xiàn)密集平行排列的肌絲樣結(jié)構(gòu),但未見到肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)染組細(xì)胞沒有出現(xiàn)心肌樣跳動(dòng)。未轉(zhuǎn)染組免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)、RT-PCR和Western Blot結(jié)果均呈陰性,電鏡觀察未見分化的細(xì)胞。 3 5-氮胞苷誘導(dǎo)外源表達(dá)Nkx2-5的P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)向心肌分化 在5-aza誘導(dǎo)時(shí),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞較未加誘導(dǎo)劑的P19細(xì)胞生長緩慢,每日有多個(gè)細(xì)胞死亡、變圓漂浮。隨著細(xì)胞數(shù)目增多,聚集成類似于聚集體貼壁生長的狀態(tài),中心細(xì)胞小、密集,周邊細(xì)胞爬出,呈放射狀排列,胞體變長呈梭形,并伸出突起。細(xì)胞形成聚集生長之后,死亡細(xì)胞變少。兩組在培養(yǎng)過程中都沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞跳動(dòng)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組在5-aza誘導(dǎo)后8天兩種抗體有陽性表達(dá),12天、16天的表達(dá)量逐漸增多,細(xì)胞中棕黃色成束絲樣結(jié)構(gòu)增多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:α-sarcomeric actin的表達(dá),16天與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.01)。cTnT的表達(dá)16天與8天比有顯著差異(P0.01)。對(duì)照組細(xì)胞在5-aza誘導(dǎo)的4、8、12、16天均沒有檢測(cè)到α-sarcomeric actin和cTnT的陽性表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:在實(shí)驗(yàn)組,α-sarcomeric actin和cTnT兩種抗體在5-aza誘導(dǎo)的第8天、12天、16天時(shí)有表達(dá),且表達(dá)量呈逐漸增高的趨勢(shì),兩種蛋白在同一細(xì)胞相同部位重疊表達(dá)。對(duì)照組沒有兩種蛋白的共表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組GATA-4在誘導(dǎo)的4天有表達(dá),8天、12天、16天表達(dá)逐漸增多。α-MHC和ANP在5-aza誘導(dǎo)后的8天有表達(dá),12天和16天表達(dá)逐漸增多;統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:GATA-4表達(dá)量12天、16天與4天比有顯著差異(P0.01),16天與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.05)。α-MHC在16天、12天的表達(dá)量與8天比有顯著差異(P0.01),16天的表達(dá)量與12天比有顯著差異(P0.01)。ANP在16天、12天的表達(dá)量與8天比增高,有顯著差異(P0.01),16天表達(dá)量與12天比增高,有顯著差異(P0.05)。在對(duì)照組,ANP沒有表達(dá);GATA-4在8天、12天、16天有表達(dá),表達(dá)量逐漸增高,4天時(shí)沒有表達(dá)。α-MHC在12天、16天時(shí)有表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:GATA-4的表達(dá)只有16天與8天比有顯著差異(P0.05)。α-MHC在12天、16天時(shí)的表達(dá)沒有顯著差異。RT-PCR結(jié)果在兩組之間有差異,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞GATA-4、α-MHC表達(dá)提前,且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞兩個(gè)基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比均增高,除了α-MHC在12天的表達(dá)兩組間沒有顯著差異,其他時(shí)間點(diǎn)都有顯著差異(P0.01或P0.05);對(duì)照組ANP沒有表達(dá),而在實(shí)驗(yàn)組ANP有表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞α-sarcomeric actin和cTnT在8天、12天和16天時(shí)有表達(dá),且表達(dá)逐漸增高;在實(shí)驗(yàn)組,16天、12天時(shí)α-sarcomeric actin的表達(dá)與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.05)。16天、12天時(shí)cTnT的表達(dá)與8天比有顯著差異(P0.01);對(duì)照組兩種蛋白沒有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組電鏡觀察發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞相鄰處分化出細(xì)胞連接,連接的兩側(cè)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微絲樣結(jié)構(gòu)。有些相鄰細(xì)胞間伸出相互嵌合的突起并分化出幼稚的細(xì)胞連接,類似心肌閏盤的早期結(jié)構(gòu)。部分細(xì)胞的胞質(zhì)中,可見密集平行排列肌絲樣結(jié)構(gòu),肌絲樣結(jié)構(gòu)上有電子密度高的區(qū)域,類似于幼稚的明暗帶結(jié)構(gòu)或平滑肌的密斑密體結(jié)構(gòu)。 結(jié)論: 1成功擴(kuò)增出人Nkx2-5基因編碼框;成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5,為以后研究Nkx2-5基因在心肌分化和心臟發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5可在P19細(xì)胞中表達(dá),可以用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選。 3外源表達(dá)Nkx2-5基因的P19細(xì)胞不需誘導(dǎo)劑,只聚集培養(yǎng)即可向心肌細(xì)胞分化,誘導(dǎo)心肌標(biāo)志物和橫紋肌標(biāo)志物的表達(dá),且表達(dá)量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。外源表達(dá)Nkx2-5基因可誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌分化。 4 5-aza誘導(dǎo)使單層培養(yǎng)的P19細(xì)胞向心肌分化,表達(dá)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異基因,但是沒有蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。 5 5-aza誘導(dǎo)使單層培養(yǎng)的外源表達(dá)Nkx2-5基因的P19細(xì)胞向心肌分化,在基因水平和蛋白水平表達(dá)心肌標(biāo)志物和橫紋肌標(biāo)志物,且表達(dá)量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。 6在5-aza誘導(dǎo)單層培養(yǎng)時(shí),外源表達(dá)Nkx2-5基因的P19細(xì)胞向心肌分化的情況優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的P19細(xì)胞。說明Nkx2-5基因可以促進(jìn)P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)向心肌細(xì)胞的分化。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1448998