本文關(guān)鍵詞： GTP環(huán)化水解酶Ⅰ(GCH-1) 磷酸化 Roseovitine 一氧化氮(·NO) 四氫生物蝶呤(BH4) NFκB　出處：《山東大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景 GTP環(huán)化水解酶Ⅰ(GCH-1)是四氫生物蝶呤(BH4)生物合成過程中的第一個催化酶,也是重要的限速酶。而BH4又是芳香族氨基酸羥化酶,一氧化氮合酶(NOS)亞基和甘油醚單加氧酶的一種重要的輔助因子。GCH-1突變導致的BH4缺乏已被證明會引起苯丙酮尿癥和多巴反應性肌張力障礙(DRD)。因此,BH4在調(diào)節(jié)NOS活性中起到至關(guān)重要的作用。已有文獻指出BH4有助于將NOS血紅素鐵轉(zhuǎn)化成高自旋狀態(tài),并且可以增加NOS與精氨酸酶的親和力。BH4還有利于NOS還原酶的電子傳遞,以及穩(wěn)定NOS的二聚體結(jié)構(gòu)。當BH4產(chǎn)生受限時,NOS催化的O2與L-精氨酸的耦合減少,致使NOS催化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(02··-)增多,而一氧化氮(·NO)并未增多。此外,值得注意的是,BH4還容易被氧化為二氫生物蝶呤(BH2),而這種氧化產(chǎn)物對NOS沒有任何輔助作用。目前研究已發(fā)現(xiàn),BH4的減少(被消耗或被氧化)與高血壓,動脈硬化,糖尿病,心肌肥厚,以及心肌缺血有關(guān)。而且,無論在體內(nèi)還是體外實驗中都已證實,GCH-1在心血管生理中對調(diào)節(jié)BH4的產(chǎn)量和NOS的活性發(fā)揮了重要作用。此外,在內(nèi)皮細胞實驗中,GCH-1轉(zhuǎn)基因可以使BH4產(chǎn)量比基礎(chǔ)水平增加10倍以上,同時伴隨著依賴內(nèi)皮型NOS(eNOS)催化而產(chǎn)生的·NO的顯著增加。在轉(zhuǎn)基因小鼠的血管內(nèi)皮細胞中過表達人類GCH-1后,小鼠血管內(nèi)皮的BH4產(chǎn)量升高3倍,同時02··-產(chǎn)量明顯降低。因此,與野生型小鼠比較,GCH-1轉(zhuǎn)基因小鼠很好的維持了·NO的生物利用度。但也有文獻指出,轉(zhuǎn)基因小鼠中eNOS的過表達可以增加依賴eNOS的O2·-產(chǎn)生,然而有趣的是,當eNOS轉(zhuǎn)基因小鼠與GCH-1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時,O2`-產(chǎn)量又降至正常水平。 大量研究表明,GCH-1可能被磷酸化作用精細地調(diào)節(jié)著。GCH-1的磷酸化在受到血管緊張素Ⅱ,血小板衍生的生長因子或蛋白激酶C(PKC)激活劑佛波酯(TPA)刺激的細胞內(nèi)是增加的,而且GCH-1磷酸化的增加趨勢與GCH-1的活性和BH4的產(chǎn)生是一致的。同時,過表達的GCH-1是以磷酸化形式存在于肥大細胞中,并且TPA可以刺激肥大細胞中的GCH-1發(fā)生磷酸化以及刺激BH4的產(chǎn)生,而這一過程能夠被PKC抑制劑所抑制。最近,一項用人類內(nèi)皮細胞做的實驗表明,剪切應力可以激活酪蛋白激酶Ⅱ，從而增加GCH-1的絲氨酸-81位點的磷酸化程度,并提高GCH-1的活性。雖然GCH-1的磷酸化程度可以調(diào)節(jié)其活性,但是對這些潛在的磷酸化位點是如何調(diào)節(jié)GCH-1活性的系統(tǒng)性研究尚無報道。 研究目的 GCH-1是BH4生物合成過程中的限速酶,它的突變所導致的BH4的缺乏可引起多種疾病。但目前對GCH-1翻譯后的調(diào)節(jié)機制尚缺乏認識。因此,本研究的目的是找出潛在的GCH-1磷酸化位點,并確定這些特殊磷酸化位點的功能特性。 研究方法 1.質(zhì)粒的構(gòu)建：GCH-1的cDNA來自SD大鼠,將cDNA克隆到pcDNA5/FRT/TO/Topo/TA載體中。為了純化GCH-1蛋白,在其N末端加入FLAG序列。然后,以FLAG-GCH-1為模板,合成FLAG-GCH-1去磷酸化突變體(絲氨酸／蘇氨酸[S/T]突變?yōu)楸彼醄A])或模擬磷酸化突變體([S/T]突變?yōu)楣劝彼醄E]或天門冬氨酸[D])。FLAG-GCH-1突變體被命名為S51A、S51E、S51D等。同時,本課題還構(gòu)建了GCH-1綠色熒光蛋白(GCH-1-GFP)和T231A-GCH-1綠色熒光蛋白(T231A-GCH-1-GFP)。 2.穩(wěn)定的細胞株：FLAG-GCH-1和它的突變體與POG44共轉(zhuǎn)染到Flp-InTMT-RExTM-293細胞中建立穩(wěn)定的細胞系。這些表達野生型(WT)或者突變體的細胞被命名為WT-GCH-1細胞、S51A-GCH-1細胞、S51D-GCH-1細胞等。在所有實驗中,細胞用四環(huán)素(1μg/mL)刺激24小時來調(diào)控細胞內(nèi)質(zhì)粒的表達。3.質(zhì)譜分析：Top-Down質(zhì)譜用于分析HEK 293細胞中完整的FLAG-GCH-1片段。FLAG-GCH-1是從HEK293細胞中通過免疫沉淀純化得到。FLAG-GCH-1經(jīng)過脫鹽后,引入ESI/FTMS系統(tǒng)進行質(zhì)譜分析。Bottom-Up質(zhì)譜方法需要將FLAG-GCH-1用胰酶消化。消化后產(chǎn)生的多肽混合物通過有C18分離柱的nano-2DLC色譜分析系統(tǒng)而彼此分離,然后用在線LTQ MS儀進行分析。另外,Bottom-Up質(zhì)譜法還要與膠內(nèi)消化相配合。FLAG-GCH-1通過凝膠電泳將蛋白質(zhì)在不同梯度上進行分離并被免疫沉淀。然后將GCH-1帶切除、脫色和消化。由其產(chǎn)生的大量的肽段通過固相金屬親和色譜法找出磷酸化肽段,然后使用MALDI-TOF MS對磷酸化肽段進行分析。 4.BH4和BH2是用高效液相色譜法(HPLC)測定。細胞用冷的PBS清洗2遍。將細胞刮下轉(zhuǎn)入試管,離心得到的細胞經(jīng)過裂解后再次離心,取上清液用于HPLC分析。BH4和BH2測定采用Synergia Polar-RP色譜柱檢測,用氬飽和50mM磷酸鹽緩沖液(pH 2.6)洗脫。多通道電量檢測電壓設(shè)置為0-600mV。根據(jù)0mV和150mV所得到的BH4峰值面積得出BH4的標準曲線,根據(jù)280mV和365mV所得到的BH2峰值面積得出BH2的標準曲線。通過BH4和BH2的標準品測定,可以計算出樣品細胞內(nèi)的BH4和BH2濃度。最后,通過細胞內(nèi)的蛋白定量使BH4和BH2標準化。 5.磷酸化位點預測。利用3種蛋白質(zhì)磷酸化位點預測軟件對GCH-1的磷酸化位點進行預測。PredPhospho軟件：http://pred.ngri.re.kr/PredPhospho.htm;NetPhosK2.0軟件：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/;Scansites軟件：http://scansite.mit.edu/。6.通過免疫沉淀和蛋白印跡(western blot)檢測GCH-1不同位點磷酸化水平及其細胞內(nèi)的定位。 研究結(jié)果 1.質(zhì)譜分析研究表明,在HEK293細胞里過表達的大鼠GCH-1,在其絲氨酸(S)51,S167,和蘇氨酸(T)231位點發(fā)生了磷酸化。而結(jié)合計算機分析結(jié)果,共發(fā)現(xiàn)了GCH-1共有8個潛在磷酸化位點,即S51、S72、T85、T91、T103、S130、S167和T231。 2.當細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染S72A、T85A、T91A、T103A和S130A去磷酸化突變體時,GCH-1的活性和BH4的產(chǎn)量明顯降低；但是當細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染去磷酸化突變體T231A時,GCH-1的活性和BH4的產(chǎn)量卻明顯增加。 3.BH4和BH2的產(chǎn)量在轉(zhuǎn)染S51E、S72E、T85E、T91E、T103D和T130D突變體的細胞中是顯著升高的,但在轉(zhuǎn)染T231D突變體的細胞中是降低的。 4.在轉(zhuǎn)染S167A和S167E突變體的細胞中,BH2的產(chǎn)量也是增加的。 5.此外,本研究還發(fā)現(xiàn)細胞中轉(zhuǎn)染T231A突變體后可以降低GCH-1的細胞核定位以及細胞核內(nèi)GCH-1的活性。 結(jié)論 通過本實驗,我們確定了8個GCH-1的潛在磷酸化位點,并鑒定了這些位點對GCH-1的活性、BH4和BH2的生物合成,以及GCH-1的定位作用。我們首次發(fā)現(xiàn)了GCH-1活性是受多個磷酸化位點調(diào)控的,其中S51,S72,T85,T91,T103和S130位點的磷酸化起到正性調(diào)節(jié)作用,而T231位點的磷酸化起到負性調(diào)節(jié)作用。此外,該研究還首次提出了S51，，T231和S167位點的磷酸化對GCH-1活性調(diào)節(jié)的重要性。這一發(fā)現(xiàn)將會為提高BH4生物利用度提供新的思路。本課題的研究結(jié)果將有助于進一步認識在BH4產(chǎn)生過多或過少情況下,細胞水平的調(diào)節(jié)機制,尤其是該機制在心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如高血壓、冠心病、糖尿病和肌張力障礙性疾病等)中的作用。 研究背景 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成份,其化學本質(zhì)為脂多糖(LPS),為細菌死亡或活躍繁殖時所釋放。LPS本身無毒性作用,但能夠刺激體內(nèi)多種細胞合成并釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子。巨噬細胞積極地參與了宿主防御和炎癥過程。當機體暴露于革蘭氏陰性菌時,巨噬細胞被細菌細胞壁上的脂多糖激活,從而引發(fā)大量·NO和炎性細胞因子的釋放。大量產(chǎn)生的·NO的衍生物可以破壞細菌,但也可以引起宿主組織損傷和毒性作用�！O是在至少3種NOS的催化下產(chǎn)生的,其中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)也稱為NOS2。iNOS的作用是促進巨噬細胞在LPS刺激下產(chǎn)生大量的·NO。通過與Toll-like receptor 4(TLR4)的相互作用,LPS可以激活細胞內(nèi)信號通路,包括有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NFκB)通路,同時可以上調(diào)巨噬細胞內(nèi)iNOS的表達。NFκB通路是iNOS介導過程及炎癥反應中最重要的信號通路。P50(NFκB1)／p65的(RelA)異源二聚體是NFκB最普遍存在的形式。各種炎癥刺激均可誘導NFκBp65(絲氨酸536)發(fā)生磷酸化反應,而p65的磷酸化是調(diào)節(jié)NFκB的激活、細胞核定位和轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵。 BH4是NOS的一種重要的輔助因子,并且已被證明可以調(diào)節(jié)iNOS活性及iNOS依賴的·NO的產(chǎn)生。GCH-1是催化BH4生物合成中的第一步,且是該合成過程的限速酶。有資料顯示,GCH-1轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS的刺激下,腎臟的iNOS的表達與NO含量顯著提高。GCH-1的抑制劑可以明顯抑制LPS誘導的NO·的產(chǎn)生和干擾素γ誘導的iNOS的表達。 在本實驗第一部分關(guān)于GCH-1磷酸化調(diào)節(jié)研究中,通過對GCH-1磷酸化位點的突變,將大鼠GCH-1的85位點蘇氨酸(T85)突變?yōu)楸彼?使其去磷酸化而功能喪失,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCH-1活性和BH4產(chǎn)生能夠被完全抑制。因為GCH-1的T85位點與周期序列依賴性蛋白激酶5(CDK5)有著相同的序列,所以我們提出的假設(shè)是CDK5被抑制后可能會抑制GCH-1磷酸化,從而抑制巨噬細胞內(nèi)·NO的產(chǎn)生。然而,結(jié)果顯示CDK5抑制劑roscovitine可以直接抑制LPS誘導的GCH-1表達(mRNA和蛋白水平)。 研究目的 根據(jù)預實驗的結(jié)果,我們推測roscovitine抑制LPS誘導的NO·的產(chǎn)生是通過roscovitine沮止了BH4的生物合成及抑制了LPS激活的NFκB途徑或MAPK途徑。因此,本研究的目的是探討在LPS刺激的巨噬細胞內(nèi),roscovitine對iNOS及GCH-1的表達、·NO的產(chǎn)生、BH4的生物合成以及NFκB途徑和MAPK途徑的抑制作用。 研究方法 在與炎癥有關(guān)的疾病中,細胞內(nèi)毒素的釋放所導致的·NO和細胞因子產(chǎn)生過多與組織損傷之間有至關(guān)重要的關(guān)系。因此,我們用LPS刺激小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞,探究了不同濃度roscovitine對小鼠巨噬細胞中一氧化氮產(chǎn)生的抑制作用的區(qū)別。為了確定roscovitine是否有潛在的細胞毒性作用,首先分別用1μM,10μM and 25μM的roscovitine處理RAW 264.7巨噬細胞24個小時,細胞的存活力用MTT方法檢測。然后用roscovitine(1μM,10μM and 25μM)預處理巨噬細胞30min,隨后用LPS(2μg/m1)刺激12小時后檢測巨噬細胞中·NO的產(chǎn)量,并且應用HPLC檢測BH4和BH2的產(chǎn)量。為了明確roscovitine對NFκB信號通路的抑制作用,將經(jīng)過roscovitine干預后的巨噬細胞用LPS刺激,提取其中的RNA和蛋白質(zhì),并通過RT-PCR和western blot方法檢測NFκB途徑和MAPK途徑的蛋白酶活性及其表達水平,并與未經(jīng)roscovitine干預的對照組進行了比較。同時我們也檢測了可以調(diào)節(jié)IκB磷酸化的上游激酶IKK。其次,本實驗還分析了受NFκB活性影響的特殊基因(如COX-2,IL-1p,IL-6和TNFα)的表達。再次,由于文獻報道roscovitine對CDK1,CDK5和CDK7均有抑制作用,我們用不同種類和不同濃度的CDK抑制劑干預巨噬細胞,從而確定是哪種CDK起作用。最后,考慮到實驗用的RAW264.7巨噬細胞系并不能完全代表未經(jīng)修飾的巨噬細胞,我們又分離了大鼠腹腔巨噬細胞進一步驗證了roscovitine對LPS誘導的炎性反應的抑制作用。 研究結(jié)果 1.在RAW264.7巨噬細胞中,roscovitine能夠抑制LPS誘導的·NO的產(chǎn)生,并明顯抑制了由LPS誘導的iNOS的mRNA和蛋白質(zhì)表達。2.結(jié)果顯示,roscovitine能夠抑制LPS誘導的NFκB活性。同時,roscovitine減弱了LPS誘導的IKKβ、IKB和p65的磷酸化,但增強了ERK、P38和JNK的磷酸化程度。3.RT-PCR實驗結(jié)果顯示LPS明顯增加了IL-1β和IL-6的mRNA表達,而當roscovitine劑量為10“M和25μM時,對上調(diào)的IL-1β和IL-6有顯著的抑制作用,并呈劑量依賴性。但結(jié)果顯示,roscovitine對LPS誘導的TNFα表達上調(diào)沒有抑制作用。4.Roscovitine增強了LPS誘導的MAPK活性。Roscovitine不僅對LPS誘導的ERK活性的增加沒有抑制作用,相反,roscovitine還使ERK磷酸化程度在LPS刺激后的30min和60min時變得更強。與ERK結(jié)果相似,roscovitine增強了LPS刺激后15min和30min時的p38磷酸化程度,同時也增強了LPS刺激后0min和180min時的JNK磷酸化程度。5.經(jīng)過12個小時LPS的刺激,細胞內(nèi)BH4的產(chǎn)量高于正常水平的6倍。Roscovitine可以極大程度地抑制LPS誘導的BH4水平的增高,甚至使BH4水平降至低于對照組水平。同時,roscovitine也顯著降低了BH4/BH2比值,而這個比值對NOS聚合活性的影響有著與總BH4濃度同樣的重要性。此外,LPS也明顯增加了GCH-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達,而roscovitine預處理后顯著抑制了LPS誘導的GCH-1的表達。 6.我們使用其他CDK抑制劑發(fā)現(xiàn),CDK1,CDK 5和CDK7抑制劑明顯抑制了LPS誘導的巨噬細胞中·NO產(chǎn)生,但CDK2的抑制劑對其無明顯抑制作用。 7.在分離的大鼠腹腔巨噬細胞中,roscovitine顯著地抑制了·NO的生成、iNOS和COX-2的表達、NFκB的活性,以及LPS誘導的GCH-1表達的增加。結(jié)論 1.實驗結(jié)果表明,roscovitine能夠通過抑制NFκB的激活和BH4的生物合成,抑制LPS誘導的巨噬細胞內(nèi)·NO產(chǎn)生。而這種抑制作用可能是由CDK1,CDK5和CDK7所介導的。 2.研究結(jié)果還證實了roscovitine可以抑制炎癥,而CDKs在其抗炎機制中起到了重要的作用。 3.此外我們發(fā)現(xiàn),roscovitine對LPS誘導的MAPK的活性沒有抑制作用,相反是加強作用。這說明MAPK可能沒有參與roscovitine對LPS誘導的iNOS和·NO產(chǎn)生的抑制過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R341

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8 董莎莎;云芝糖肽（PSP）對LPS刺激的小鼠巨噬細胞ROS及MAPK信號通路的研究[D];上海師范大學;2011年

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10 馮琳琳;LPS、TGF-β1對小鼠BMDC的影響及TGF-βRⅠ在哮喘遺傳背景不同小鼠BMDC中的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

本文編號：1447693