發(fā)布時間：2018-01-20 01:45

  本文關(guān)鍵詞： 小分子干擾RNA 基因沉默 MAS　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：探討體外直接轉(zhuǎn)染以大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F）MAS基因為靶標(biāo)的小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）后，NRK-49F的MAS基因的mRNA表達和蛋白水平是否受到抑制，篩選出高效的siRNA，為進一步研究MAS基因在腎臟疾病中的作用機制提供實驗基礎(chǔ)。方法：（1）靶向MAS基因的siRNA的設(shè)計及合成：通過NCBI檢索大鼠MAS基因序列，按照siRNA序列設(shè)計原則設(shè)計并合成特異性沉默MAS的siRNA3對：siRNA-1（5'-CCUGACCAGAGCUUUCAAATT-3'，5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3'）、siRNA-2（5'-GACCAAUCAAAUAUGACAUTT-3'，5'-AUGUCAUAUUUGAUUGGUCTT-3'）、siRNA-3（5'-GCCAUUACUACACAAUCGUTT-3'，5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3'）；陰性對照siRNA（siRNA-neg）（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）1對。（2）細(xì)胞培養(yǎng)：NRK-49F細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中（含有l(wèi)0％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中，用0.25%胰酶消化傳代，，待細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞呈對數(shù)生長后，將細(xì)胞制成1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板進行實驗。（3）實驗分組:①MAS siRNA-1：加入含siRNA序列1的轉(zhuǎn)染混合物（transfection complexes，TC）；②MAS siRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MAS siRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④陰性對照組（CG）：加入含siRNA陰性序列的TC；⑤空白對照組(NG)：只加入轉(zhuǎn)染試劑；每組設(shè)3個復(fù)孔。（4）轉(zhuǎn)染：將HiPerFect TransfectionReagent12ul與無血清無雙抗培養(yǎng)液混合，配成100ul轉(zhuǎn)染液后，再加入終濃度為10nM的siRNA,兩者混勻常溫孵育5-10分鐘。將轉(zhuǎn)染混合物加入六孔板中，輕輕晃動保證轉(zhuǎn)染混合物分布均勻，恒溫箱中孵育，48小時后檢測轉(zhuǎn)染效率。（5）基因表達檢測：應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（rever-setranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR）與蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測轉(zhuǎn)染前后MAS的mRNA與蛋白表達的變化。（6）圖像處理：采用Quantity One4.4.0軟件測定各組灰度值。（7）統(tǒng)計分析：應(yīng)用軟件spss17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，通過單因素方差分析檢驗各組間差異性，P0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：經(jīng)siRNA干擾后，3條靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表達。RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示siRNA-1組、siRNA-2組及siRNA-3組NRK-49F細(xì)胞MAS的mRNA水平與空白對照組相比顯著降低(P〈0.05),各組MAS與GAPDH灰度值的比值分別為0.5772±0.0220，0.3380±0.0434，0.6164±0.0767，抑制率分別達到26.89％，57.12％，21.73％，而陰性對照組和空白對照組之間mRNA的表達水平比較則無顯著下降。Western blot方法檢測結(jié)果顯示：3條靶向MAS的特異性序列siRNA蛋白表達水平與空白對照組相比顯著降低(P〈0.05)，抑制率分別為59.47％，67.81％,50.32％，而陰性對照組和空白對照組之間蛋白的表達水平則無明顯差異，與RT-PCR結(jié)果基本一致。結(jié)論：1.體外轉(zhuǎn)錄合成的靶向MAS基因的siRNA可通過陽離子復(fù)合物介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染至大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，并發(fā)揮基因抑制的作用。2.成功篩選出一組能夠高效率特異性沉默大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MAS基因的siRNA。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of direct transfection of small interfering RNA(small interferingRNA targeting NRK-49 FMAs on rat renal interstitial fibroblasts in vitro. Whether the mRNA expression and protein level of the MAS gene of NRK-49F were inhibited after siRNAs, the highly efficient siRNA was screened out. To provide experimental basis for further study of the mechanism of MAS gene in renal disease. Methods: 1). Design and synthesis of siRNA targeting MAS gene: search rat MAS gene sequence by NCBI. According to the principle of siRNA sequence design, the siRNA3 pair of specific silencing MAS was designed and synthesized. 5 '-CCUGACCAGAGCUUUCAAATT-3'. 5UUGAAAGCUGCUGUCAGGTT-3'siRNA-2UUCAAUAUGACAUTT-3'. 5AUGUUUUUGUGUCTT-3 siRNA-3CCAUUAUACAAUCGUTT-3'. ACGAUGUGUAGUAGCTT-3; Negative control siRNA-negative siRNA-UUCUCCGAACGUGUCGCAUTT-3'. 5ACGUGACACGUGACGGAGAATT-3K1) cells were cultured in DMEM/F12 medium (% NRK-49F). Contains 10% fetal bovine serum. 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin were digested with 0.25% trypsin in a sterile incubator at 37 鈩

本文編號：1446345