本文關鍵詞：SDF-1調控表皮干細胞生物學功能的初步研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 皮膚組織有著很強的再生能力,表皮基底層中的干細胞終身不斷自我更新、持續(xù)分化以取代終末分化細胞,從而進行組織結構的更新。終末分化細胞的死亡、脫落與基底干細胞的分裂維持一定的平衡,這是維持正常的表皮組織結構和細胞內環(huán)境穩(wěn)定的基本要求[1]。隨著分子生物學、細胞生物學、組織工程學及生物工程學等學科的發(fā)展,表皮干細胞(Epidermal stem cell, ESC)憑借其特有的生物學優(yōu)勢在基因治療、細胞治療中越來越受到重視,成功地分離、培養(yǎng)表皮干細胞對臨床上創(chuàng)傷修復、皮膚癌的研究也起著至關重要的作用[2-8]。 皮膚創(chuàng)面的修復是一個多細胞與細胞因子參與的復雜過程。創(chuàng)傷早期,創(chuàng)緣周圍產生大量滲出液,多種細胞因子可能調節(jié)創(chuàng)傷修復過程中的細胞反應,影響細胞增殖、遷移、細胞外基質合成和釋放等。 間質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是由間質細胞分泌,并被證實在多種成體組織損傷修復過程中介導成體干細胞向受損區(qū)域遷移,參與創(chuàng)傷修復。因此我們推測SDF-1很可能在皮膚組織創(chuàng)傷后也有表達,并進而影響表皮干細胞在創(chuàng)緣的分布變化及數量改變。 目的 1.利用改良的人胎盤Ⅳ型膠原快速粘附法從人包皮組織獲得ESC并進行無血清培養(yǎng),觀察其體外培養(yǎng)的生長特點,尋求一種理想的人ESC體外分離培養(yǎng)技術。 2.觀察SDF-1對體外培養(yǎng)的人ESC增殖、遷移等生物學活性的影響,并初步探討其作用機制。 3.以ESC為種子細胞構建三維皮膚等價物(three dimensional skin equivalents, TDSE)全層創(chuàng)傷模型,觀察皮膚創(chuàng)面發(fā)生過程中創(chuàng)緣SDF-1的表達及ESC的動態(tài)變化,分析二者相關性。 方法 1.按照Dispase II-胰酶兩步消化法從人包皮組織獲得ESC,以人胎盤Ⅳ型膠原按照5μg/cm2的密度包被培養(yǎng)瓶,將ESC以無血清培養(yǎng)基(defined keratinocyte-serum free medium,DK-SFM)進行體外培養(yǎng),觀察其生長及形態(tài)變化、克隆形成,并對原代培養(yǎng)的ESC表面標記物β1-integrin、CK19、PCNA進行細胞免疫組織化學染色,對CD49f和分化標記CD71雙染進行免疫熒光鑒定。 2.通過MTT實驗檢測不同濃度SDF-1對ESCs增殖的影響,以及在相同濃度SDF-1作用下另添加不同濃度AMD3100對ESCs增殖的影響;通過劃痕實驗,檢測不同濃度SDF-1對ESCs趨化遷移的作用趨勢,及SDF-1促遷移運動的時間效應。 3.將成纖維細胞與鼠尾膠原、DMEM培養(yǎng)基、血清按比例混勻制成“真皮等價物”。經過72h培養(yǎng),原代人角質形成細胞接種在真皮等價物的表面。繼續(xù)培養(yǎng)1周后,抬高到氣-液面,使ESC分化為各層,最終形成“三維皮膚等價物”隨后,用液氮冷凍的金屬棒凍傷模型,建立離體全層凍傷創(chuàng)面。在凍傷后3、7天、10天取材免疫組化染色觀察創(chuàng)緣SDF-1的表達變化;另添加外源性SDF-1和其受體阻斷劑AMD3100作用后,在凍傷后3、7天取材免疫組化染色觀察創(chuàng)緣ESCs的分布變化。 結果 1.Ⅳ型膠原分選的粘附細胞在DK-SFM培養(yǎng)基中生長良好,細胞胞體呈圓形,細胞核大,核質比大,培養(yǎng)9天能行成含200個細胞以上的大克隆,呈鋪路石樣鋪滿瓶底。β1-integrin、CK19、PCNA均呈陽性表達。免疫熒光法雙重標記顯示細胞為α6briCD71dim細胞。 2. SDF-1α濃度依賴性的促進ESC的增殖、遷移作用。在100ng/ml時促增殖和遷移的作用最顯著,AMD3100則能有效阻斷上述增殖和遷移的作用。 3.利用ESC為種子細胞成功構建了三維皮膚等價物全層凍傷模型。HE染色顯示正常未凍傷區(qū)細胞分層良好,凍傷創(chuàng)緣區(qū)表皮細胞壞死增多,表皮層變薄。免疫組織細胞化學染色顯示,凍傷發(fā)生后,創(chuàng)緣周圍組織中SDF-1表達量不斷增加。但是表達量的增加不是持續(xù)的,第7天即為高峰,隨后表達量迅速減少。至愈合晚期,局部無SDF-1表達。伴隨創(chuàng)面愈合進程,ESC的定位分布不象正常皮膚那樣呈單層片狀、散在分布于表皮基底層,而是向創(chuàng)面遷移聚集的趨勢更加明顯,且在多層內出現散在β1整合素陽性細胞。組織形態(tài)學上表現為新生表皮組織較正常組織明顯增厚。 結論 1.對人ESC的體外無血清培養(yǎng)方法進行觀察發(fā)現通過Ⅳ型膠原快速粘附法能有效的分離ESC。 2.外源性的SDF-1α對ESC增殖和遷移的促進作用,這些影響是通過SDF-1α及其受體CXCR4的相互作用實現的。 3. TDSE離體創(chuàng)面愈合過程中,SDF-1在創(chuàng)緣呈可控性表達;SDF-1通過趨化效應引起ESC在創(chuàng)緣的異位分布,并且與增殖效應一起共同作用加速實現創(chuàng)面的上皮化過程。
[Abstract]:Skin tissue has a strong regeneration ability , and the stem cells in the basal layer of the epidermis are constantly self - renewing and continuously differentiated to replace the terminal differentiation cells , so as to carry out the renewal of the tissue structure . The death and the shedding of the terminal differentiated cells and the division of the basal stem cells maintain a certain balance , which is the basic requirement for maintaining the normal epidermal tissue structure and the homeostasis of the environment in the cells . With the development of molecular biology , cell biology , tissue engineering and biology engineering , epidermal stem cell ( ESC ) has been paid more and more attention in gene therapy and cell therapy by virtue of its unique biological advantages . Repair of skin wound is a complex process involving a multi - cell and cytokine participation . During the early period of trauma , a large amount of exudate is produced around the wound , and various cytokines may regulate cell responses during wound repair , affect cell proliferation , migration , extracellular matrix synthesis and release , etc . The stromal cell - derived factor - 1 ( SDF - 1 ) is secreted by the stromal cells and is confirmed to mediate the migration of adult stem cells to the damaged region during the repair process of multiple adult tissue damage . Therefore , it is speculated that SDF - 1 is likely to be expressed after the skin tissue trauma , and further affects the distribution and the number of epidermal stem cells in the wound . Purpose 1 . Using the improved human placental type 鈪，

本文編號：1435988