本文關(guān)鍵詞：C57小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器結(jié)構(gòu),細(xì)胞無論是自身正常的生理變化還是由于對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)而使蛋白質(zhì)產(chǎn)生上調(diào)或下調(diào)的變化,大部分都要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來實(shí)現(xiàn),這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)合成分泌到細(xì)胞外或是定位到細(xì)胞膜、線粒體和溶酶體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)。另外細(xì)胞大部分的脂類都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還擔(dān)負(fù)著細(xì)胞解毒和鈣離子儲(chǔ)存等功能。 在目前已知的蛋白質(zhì)200多種翻譯后修飾中,糖基化修飾和磷酸化修飾是最為主要和分布最廣的翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)糖基化修飾極大程度地改變了蛋白質(zhì)的理化性質(zhì):分子量增加、溶解性增大等;并影響著蛋白質(zhì)的功能。細(xì)胞內(nèi)50%的蛋白質(zhì)是糖基化修飾蛋白質(zhì),對生物樣本中糖蛋白的修飾位點(diǎn)和糖型進(jìn)行系統(tǒng)的研究,有助于闡明由于糖基化位點(diǎn)或是糖型改變引起的疾病的發(fā)病機(jī)理。但是由于糖基化修飾本身存在微不均一性等特點(diǎn),使糖基化修飾成為目前蛋白質(zhì)組研究的難點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用,它幾乎涉及所有的生理及病理過程,如代謝、細(xì)胞的生長發(fā)育、癌變等,是目前蛋白質(zhì)組中翻譯后修飾研究的熱點(diǎn),系統(tǒng)地對生物樣本中磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究,有助于闡明磷酸化介導(dǎo)的生理病理機(jī)制;但是磷酸化蛋白質(zhì)在樣本中含量低且動(dòng)態(tài)范圍廣,這些特點(diǎn)決定了其相關(guān)研究的挑戰(zhàn)性。 本文以C57小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為模式樣本,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾和磷酸化修飾進(jìn)行了研究。 論文第一部分建立了基于ConA富集的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)N-糖蛋白質(zhì)組研究策略。ConA是特異性較好的凝集素,在N-糖修飾蛋白質(zhì)的研究中廣泛使用,為了更好的富集生物樣品中低豐度的N-糖修飾蛋白質(zhì),我們首先對ConA的使用條件進(jìn)行了優(yōu)化,并把優(yōu)化后的使用條件用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)N-糖修飾的研究。采用密度梯度離心方法提取小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并利用ConA富集其中的N-糖修飾蛋白質(zhì),通過高準(zhǔn)確度的線性離子阱-傅立葉變換回旋共振質(zhì)譜(LTQ-FTICR-MS)對提取的N-糖修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定和修飾位點(diǎn)確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)分別在樣品水平和質(zhì)譜水平各進(jìn)行了三次重復(fù),得到了9批數(shù)據(jù),從這9批數(shù)據(jù)中共鑒定了屬于212個(gè)蛋白的309個(gè)糖基化肽段,含有323個(gè)糖基化修飾位點(diǎn),其中有81個(gè)蛋白質(zhì)的糖基化修飾位點(diǎn)未被Swissprot庫收錄。 論文第二部分以9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及線粒體蛋白質(zhì)為樣本,優(yōu)化了富集磷酸化肽段的SCX技術(shù)路線,并將優(yōu)化后的SCX富集路線應(yīng)用于小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的磷酸化研究。在質(zhì)譜水平進(jìn)行了3次重復(fù)鑒定,得到3批數(shù)據(jù),從這3批數(shù)據(jù)中共鑒定到了249個(gè)磷酸化位點(diǎn),分屬于161個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)的164個(gè)磷酸化肽段。其中有125個(gè)蛋白質(zhì)的磷酸化修飾位點(diǎn)未被Swissprot庫收錄。分析發(fā)現(xiàn)其中很多磷酸化蛋白質(zhì)在生物體中發(fā)揮著與肝臟的生理和病理密切相關(guān)的重要功能。 本研究建立了基于ConA富集的N-糖蛋白質(zhì)研究策略,同時(shí)優(yōu)化了基于SCX富集的磷酸化研究策略,首次建立了N-糖基化蛋白質(zhì)修飾譜和小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)磷酸化蛋白質(zhì)修飾譜,為研究N-糖基化修飾、磷酸化修飾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能發(fā)揮及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The endoplasmic reticulum ( ER ) is an important organelle structure in the cell , and the changes of the protein production up - regulated or down - regulated due to the stress response to the environment , most of which are to be realized through the endoplasmic reticulum , because the endoplasmic reticulum of the cell is responsible for the synthesis of the protein secreted into the cell or the organelle such as the cell membrane , mitochondria and lysosomes . Glycation modification and phosphorylation modification are the most important and widely distributed post - translational modifications in the currently known protein 200 . The protein glycosylation modification greatly alters the physical and chemical properties of proteins : the increase of molecular weight , the increase of solubility , etc . In this paper , the N - glycosylation modification and phosphorylation modification of the endoplasmic reticulum protein were studied by taking C57 mouse liver endoplasmic reticulum as a model sample . In the first part , we have established the research strategy of N - sugar protein in the endoplasmic reticulum , which is based on the concentration of N - sugar . In order to enrich the N - sugar modified protein with low abundance in biological sample , we first optimize the use condition of Con A and use the optimized conditions for N - sugar modification of endoplasmic reticulum . In the second part , nine standard proteins and mitochondrial proteins were used as samples to optimize the SCX technology route for enriching phosphorylated peptide segments , and the optimized SCX enrichment route was applied to the phosphorylation of protein in liver endoplasmic reticulum . In this paper , we established a research strategy of N - sugar protein based on concanavalin enrichment , meanwhile , optimized the phosphorylation research strategy based on SCX enrichment , established the modified spectrum of N - glycosylation protein modification and the phosphorylation protein modification of mouse liver endoplasmic reticulum , and laid a foundation for the study of the function of N - glycosylation modification and phosphorylation modification in the endoplasmic reticulum and the related function of endoplasmic reticulum .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R341

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