本文關(guān)鍵詞：臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中VEB-1基因盒結(jié)構(gòu)及其對整合子捕獲頻率影響的研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 近年來由于抗生素在人類、動物、植物中的濫用,病原體對抗生素耐藥日趨嚴(yán)重,傳染性疾病的治療逐年變得更加有挑戰(zhàn)性,特別是由條件致病菌銅綠假單胞菌所引起的感染,它能夠迅速產(chǎn)生多重耐藥性,使多個抗生素失去了臨床效用。雖然移動元件所引起耐藥的機(jī)制一直都是我們關(guān)心的一個問題,但最困難的挑戰(zhàn)是我們?nèi)绾蚊鎸χ委煾腥具^程中銅綠假單胞菌迅速引起的耐藥。 對細(xì)菌抗生素耐藥機(jī)制的研究,導(dǎo)致了包括轉(zhuǎn)座子和共軛質(zhì)粒在內(nèi)的許多自然移動元件的發(fā)現(xiàn),而通過對這些元件序列進(jìn)行比較分析,最終發(fā)現(xiàn)了整合子(integron)的存在。整合子起初在病原菌的移動性元件中被發(fā)現(xiàn)和鑒定,整合子現(xiàn)在被認(rèn)為是一種古老的結(jié)構(gòu)并且能夠存在于不同菌種中,在如今已經(jīng)被測序鑒定的菌種中,有大約9%含有整合子�？偟膩碚f,基因盒有著非常高的多樣性,暗示著整合子-基因盒系統(tǒng)在提高大多數(shù)細(xì)菌對環(huán)境適應(yīng)性上都起到很大的作用。整合子定位于革蘭陰性桿菌的染色體、轉(zhuǎn)座子或具有廣泛宿主的質(zhì)粒上,整合子是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可水平傳遞耐藥基因的DNA元件。整合子在細(xì)菌中通過位點特異性重組來捕獲基因盒,并且通過啟動子來確保這些耐藥基因的表達(dá)。同時整合子可謂與質(zhì)粒,或者自身周圍轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而發(fā)生轉(zhuǎn)移,使耐藥基因發(fā)生播散。 本研究通過對臨床多重耐藥銅綠假單胞菌整合子中的VEB-1基因盒的篩查與結(jié)構(gòu)分析,并利用一種簡便的實時定量PCR的方法,來研究VEB-1基因盒的結(jié)構(gòu)特點以及其中的某些結(jié)構(gòu)對整合子捕獲效率的影響,從而分析解釋一些臨床耐藥性基因盒的播散現(xiàn)象。 第一部分：臨床菌株中含有VEB-1型基因盒的整合子篩選 VEB-1基因盒存在于整合子上,并且編碼超廣譜內(nèi)酰胺酶VEB-1 (Vietnamese extended-spectrum b-lactamase)。VEB-1基因盒最初在越南臨床分離的一株大腸埃希菌株中被發(fā)現(xiàn),隨后也是在越南的2株臨床分離的銅綠假單胞菌中被檢測和鑒定。在泰國、中國等東南亞地區(qū)的銅綠假單胞菌中也檢測到該型ESBL。 本研究選取了2004年6～11月間,華山醫(yī)院微生物實驗室經(jīng)梅里埃儀鑒定后收集并鑒定的37株全耐藥銅綠假單胞菌株,設(shè)計引物擴(kuò)增其中含有VEB-1基因盒的菌株,再利用高分辨率敏感曲線HRM來分型,辨別VEB型基因盒中的VEB-1與VEB-3基因盒。設(shè)計引物擴(kuò)增臨床分離VEB-1基因盒的5cs端,了解其基因環(huán)境,然后進(jìn)行測序分析。最后,我們在37株全耐藥銅綠假單胞菌中,發(fā)現(xiàn)有35株存在VEB型基因,說明VEB型基因盒在多重耐藥細(xì)菌中分布很廣泛。經(jīng)過hrm分型,并測序確定型別后,得到9株VEB-1型基因盒。經(jīng)過PCR擴(kuò)增以及測序并Blast比對之后,了解到9株細(xì)菌中有8株5cs都含有IS1999插入序列。再經(jīng)過ERIC PCR鑒定后,只有3株為同一型別,其他幾株都互為不同型別。提示IS1999廣泛分布于多重耐藥銅綠假單胞菌VEB-1基因盒上游。 第二部分：研究VEB-1上游IS1999結(jié)構(gòu)對整合子捕獲效率的影響 根據(jù)第一部分的研究結(jié)果,所有VEB-1基因盒都位于整合上,并且為第一位整合基因盒,另外有一段長lkb左右的插入序列廣泛存在于多重耐藥銅綠假單胞菌中VEB-1基因盒的上游,引起了我們對此結(jié)構(gòu)與整合子整合效率的興趣。有前人的研究顯示,IS1999本身編碼402氨基酸蛋白的轉(zhuǎn)座酶,其中與IS10有71%的氨基酸同源性,所以也屬于IS4插入序列家族。IS1999片段總共有1,328bp,有21-bp的不完全重復(fù)片段位于兩側(cè),并且可以在轉(zhuǎn)座之后生成一個9bp的重復(fù)目標(biāo)片段,介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子以及轉(zhuǎn)座片段的水平移動。 本研究用長引物法構(gòu)建lacZα基因盒,并連接到載體pACYC184質(zhì)粒中,命名為pAC-lac。再從臨床分離銅綠假單胞菌684號菌株中擴(kuò)增出含有IS1999插入序列的attI位點VEB-1基因盒片段,從961號菌株中擴(kuò)增出上游是普通attI位點的VEB-1基因盒片段。把這兩個片段構(gòu)建進(jìn)入pAC-lac,利用相對定量PCR的方法,比較出兩者不同的基因盒捕獲頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),含有IS1999片段的整合子,其捕獲基因盒插入到VEB-1基因盒之前的能力與普通的整合子結(jié)構(gòu)相比大大下降,由此可推測,IS1999結(jié)構(gòu)可阻斷有效整合的途徑,阻止整合子捕獲其他基因盒,從而保持VEB-1在整合子的優(yōu)勢位置。 第三部分：比較不同attC位點結(jié)構(gòu)對VEB-1基因盒整合效率的影響 Ⅰ類整合子包括編碼整合酶的基因(IntI)和毗鄰的一個重組位點(attI)�；蚝胁⒉皇钦献颖匾脑�,不過一旦被整合,則他們也成為了整合子的一部分,依賴在整合子上的啟動子(Part)來表達(dá),啟動子也是整合子5’保守區(qū)間的一部分。另外,整合子中的其他序列(比如3’端)可以是保守的,但并不是所有整合子中都具有同源性�；蚝邪艘粋�編碼序列。在3’末端存在一段堿基,被稱作59-堿基序列,或者attC位點。 本研究比較VEB-1與VIM-2這兩種臨床上常見的播散程度不相同的基因盒,并且構(gòu)建將VEB-1基因盒中的attC位點換成VIM-2的attC位點后的基因盒,然后利用一種簡單的定量PCR方法,設(shè)計合理引物,來擴(kuò)增發(fā)生整合的基因盒,從而測定不同基因盒之間整合頻率是否有差別；并且可以分析在基因盒中哪一部分對整合效率有所影響。并且考慮到本研究之前的實驗,菌株皆處于營養(yǎng)豐富的理想環(huán)境中,這與臨床上菌株的生存情況不符,所以我們檢測對照菌株進(jìn)行的MIC,然后取低于MIC的抗生素濃度,來進(jìn)行誘導(dǎo),觀察他們的整合頻率還是否存在區(qū)別,可基本上去除抗生素的選擇效應(yīng)。 結(jié)果表明,在沒有抗生素的情況下,VEB-1的整合頻率小于VIM-2基因盒以及置換attC位點的59VIM-VEB基因盒,說明整合效率與attC存在一定關(guān)系,而與編碼的序列關(guān)系不明顯。在加入Amp1μg/ml,其他變量都控制的條件下,這三者之間的整合效率的差別又消失了。雖然這些基因盒的attC元件以及結(jié)構(gòu)基因序列都不盡相同,但可能加入抗生素之后,細(xì)菌自身調(diào)節(jié)觸發(fā)其他自救系統(tǒng)發(fā)揮作用,從而影響到了整合的過程,這一部分原因還需要一些后續(xù)的研究來分析。
[Abstract]:In recent years , due to the abuse of antibiotics in humans , animals and plants , pathogens are becoming more and more challenging for antibiotic resistance , and the treatment of infectious diseases has become more challenging year by year , especially by the condition pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa , which can rapidly generate multiple drug resistance , which can cause multiple antibiotics to lose clinical utility . Although the mechanism of resistance caused by moving elements has always been a problem of our concern , the most difficult challenge is how we face the rapid drug resistance caused by Pseudomonas aeruginosa in the course of treatment infection . The research on the mechanism of resistance to antibiotics has led to the discovery of many natural moving elements , including transposon and conjugate plasmids , and the existence of integron has been found by comparing these elements . The integrons are now considered to be an ancient structure and can be present in different strains . Through screening and structure analysis of VEB - 1 gene cassette in clinical multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa integron , a simple and convenient method of real - time quantitative PCR was used to study the structural characteristics of VEB - 1 gene cassette and the influence of some structures on the efficiency of integrated sub - capture , thus the dissemination of some clinical drug - resistant gene cassettes was analyzed . Part I : Screening of Integrals Containing VEB - 1 Gene Box in Clinical Strain The VEB - 1 gene cassette is present on the integron and encodes the extended - spectrum b - 1 gene . VEB - 1 gene cassette was originally found in a strain of E . coli isolated clinically in Viet Nam and was subsequently detected and identified in 2 clinically isolated strains of Pseudomonas aeruginosa in Vietnam . This type of ESBL was also detected in Pseudomonas aeruginosa in Southeast Asia , such as Thailand , China . In this study , 37 full - resistant Pseudomonas aeruginosa strains were collected and identified in the microbiological laboratory of Huashan Hospital from June to November 2004 . The primers were designed to amplify the strains of VEB - 1 and VEB - 3 . The second part : study the effect of the IS1999 structure upstream of VEB - 1 on the efficiency of integrated sub - capture According to the results of the first part , all VEB - 1 gene cassettes are located on the integration , and the first integration gene cassette is the first integration gene box . In addition , a length of about lkb insertion sequence exists in the upstream of VEB - 1 gene cassette in multiple drug - resistant Pseudomonas aeruginosa , which leads to our interest in integrating the structure with the integrated sub - integration efficiency . The IS1999 fragment has a total of 1,328 bp , a 21 - bp incomplete repeat fragment is located on both sides , and a 9bp repeat target fragment can be generated after the transposition , thereby mediating the horizontal movement of the transposon and the transposition fragment . The recombinant plasmid pACYC184 was cloned into vector pACYC184 . The vector pACYC184 was inserted into pACYC184 plasmid and named pAC - lac . The third part : Compare the effect of different attC site structure on the integration efficiency of VEB - 1 gene cassette The class I integrons include a gene ( IntI ) encoding an integration enzyme and a contiguous one of the recombination sites ( attI ) . The gene cassette is not an integral element , but once integrated , they also become part of the integron , depending on the promoter ( Part ) on the integron . In addition , other sequences in the integron ( such as the 3 ' end ) may be conserved but not all of the integrons . The gene cassette contains a coding sequence . A base sequence is present at the 3 ' end , referred to as a 59 - base sequence , or attC site . In this study , we compare VEB - 1 gene cassette with vim - 2 gene cassette , and construct a gene cassette after the attC site in VEB - 1 gene cassette is changed to attC locus of vim - 2 , and then use a simple quantitative PCR method to amplify the integrated gene cassette , so as to determine whether the integration frequency is different between different gene cassettes . The results showed that the integration efficiency of VEB - 1 was less than that of vib - 2 gene cassette and substitution attC locus in the absence of antibiotics . The difference of integration efficiency between these three genes was not obvious . Although the attC elements and structural gene sequences of these gene cassettes were different , it was possible to adjust the function of the other self - rescue system after the addition of Amp1 渭g / ml and other variables , thus affecting the integration process , which also needed some subsequent studies to analyze .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

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