發(fā)布時間：2018-01-16 09:52

  本文關(guān)鍵詞：K88菌毛細胞表面呈現(xiàn)載體的初步研究　出處：《石河子大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic E .coli,簡稱ETEC)是引起嬰幼兒和新生仔豬腹瀉的主要病原之一。其致病性決定于它在宿主小腸上皮細胞上的定居能力和產(chǎn)腸毒素的能力。ETEC定居宿主小腸上皮細胞的能力是由菌體表面的菌毛介導。細胞表面呈現(xiàn)技術(shù)是近來年在針對菌毛的疫苗研究中發(fā)展起來的一種新方法。將編碼菌毛的基因在非毒素源性大腸桿菌中表達并使菌毛在細胞表面組裝成菌毛,菌毛以完整形式在細胞表面出現(xiàn),而且菌毛抗原蛋白以多聚體的形式存在,將增強菌毛抗原的免疫原性。而且可在細胞表面獲得含有外源抗原表位的雜合菌毛,即所謂的細胞表面呈現(xiàn),這是一種構(gòu)建多價活疫苗的理想途徑。 本實驗以Long and Accurate PCR技術(shù)擴增K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中,設(shè)計合成一段含ApaI和NcoI酶切位點的DNA序列,與SacI和BssHII酶切后的包含結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH的質(zhì)粒連接;設(shè)計合成耐熱腸毒素STII表位編碼序列和口蹄疫病毒(FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP1的201-200AA的線性表位編碼序列,與ApaI和NcoI酶切后的載體連接,構(gòu)建融合基因。用特異性引物PCR擴增fae操縱子的調(diào)控基因faeA和faeB及faeB上游的啟動子區(qū)域,并對所得序列進行序列分析和生物信息學分析。PCR擴增STI-STII融合基因,選擇正向連接的克隆T-STI-STII,XhoI酶切后補平,與XhoI、SalI酶切后的T-LTB的小片段連接,構(gòu)建T-STI-STII-LTB質(zhì)粒;BamHI、SacI雙酶切T-STI-STII-LTB后與pET28a連接,構(gòu)建原核表達載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后表達,SDS-PAGE確定最佳誘導時間和最佳IPTG濃度。 實驗PCR獲得了K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中得到重組質(zhì)粒pBR-fae1,在pBR-fae1中引入了ApaI和NcoI酶切位點得到了質(zhì)粒pBR-fae2;在pBR-fae2的ApaI和NcoI處融合STII表位和FMDV VP1表位,成功構(gòu)建了pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1質(zhì)粒。克隆了fae操縱子的負調(diào)控基因faeA。對K88ab、K88ac兩個血清型的faeA序列分析結(jié)果顯示,兩個血清型之間不存在差異;生物信息學分析結(jié)果顯示,faeA基因表達產(chǎn)物FaeA與其他大腸桿菌菌毛操縱子的負調(diào)控蛋白序列比較發(fā)現(xiàn),FaeA與其他FaeA樣負調(diào)控蛋白同時存在一個7個氨基酸的保守區(qū)。實驗還得到了正調(diào)控基因faeB及其啟動子區(qū)域和上游調(diào)控序列;對其序列分析后顯示,在faeB基因上游的序列中包含啟動子的特征序列-35區(qū)和-10區(qū),同時存在與菌毛表達調(diào)控相關(guān)的三個GATC甲基化位點。將大腸桿菌耐熱性腸毒素ST和不耐熱性腸毒素LT的B亞單基因融合,構(gòu)建了原核表達載體pET28a-STI-STII-LTB,轉(zhuǎn)化大腸桿BL21(DE3)后誘導表達。加入IPTG至終濃度為0.8mM誘導,誘導表達后的菌體蛋白行SDS-PAGE,電泳結(jié)果顯示融合基因得到高效表達并且當誘導時間為4h時表達量達到最高。 pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1質(zhì)粒載體的構(gòu)建和兩個調(diào)控基因的獲得為在非毒素源性大腸桿菌菌毛上呈現(xiàn)外源表位奠定了基礎(chǔ)。表達的STI-STII-LTB蛋白為獲得具有強免疫原性的ST蛋白用以后續(xù)的實驗中制備ST的抗體檢測呈現(xiàn)的STII表位,提供了必要的準備。
[Abstract]:Enterotoxin E . coli ( ETEC ) is one of the main pathogens causing diarrhea in infants and newborn piglets . Its pathogenicity depends on its ability to colonize the small intestinal epithelial cells and the ability to produce enterotoxins . The structural gene faeC - faeH of K88 colony operon was amplified by Long and Polymerase Chain Reaction ( PCR ) and cloned into the plasmid vector of 322 plasmid . The DNA sequence containing ApaI and NcoI was designed and synthesized . It was ligated with the vector containing structural gene faeC - faeH after digestion with SacI and BssHII . The recombinant plasmid pBR - fae1 was cloned into the plasmid pBR - fae1 . The expression vector pET28a - fae - STII and pBR - fae - VP1 was constructed . Construction of pBR - fae - STII and pBR - fae - VP1 plasmid vectors and the acquisition of two regulatory genes provide the basis for the presentation of foreign epitopes on non - toxin - derived Escherichia coli pili . The expressed STI - STII - LTB protein provides the necessary preparation for obtaining STII epitopes for antibody detection of ST in subsequent experiments .

【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：S852.61;R378

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