本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白SseF與宿主細(xì)胞TIP60相互作用機(jī)制的研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 沙門氏菌 包裹沙門氏菌的液泡SCV Ⅲ型分泌系統(tǒng) 效應(yīng)蛋白 SseF TIP60 乙酰化修飾

【摘要】：沙門氏菌是一種兼性胞內(nèi)菌,它能夠在細(xì)胞內(nèi)一種膜性結(jié)構(gòu)中存活和繁殖,這種膜性結(jié)構(gòu)稱為包裹沙門氏菌的液泡(salmonella containing vacuoles, SCV), SCV膜的完整性及在細(xì)胞中的遷移與沙門氏菌的致病機(jī)理密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌通過(guò)一種蛋白分泌系統(tǒng),稱之為Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretion isystem, TTSS),分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)一批效應(yīng)蛋白,在細(xì)菌與宿主相互作用的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在感染細(xì)胞后所分泌的效應(yīng)蛋白中,SifA, SseF和SseG對(duì)于維持SCV膜的完整性及在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。已有的研究表明SifA通過(guò)調(diào)控液泡膜募集驅(qū)動(dòng)蛋白進(jìn)而調(diào)控SCV的定向遷移,但是對(duì)于SseF的作用機(jī)制尚不清楚,因此本課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)尋找與SseF相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,并進(jìn)一步分析其機(jī)制。 為了尋找宿主細(xì)胞中SseF的靶蛋白,首先構(gòu)建SseF的全長(zhǎng)釣餌表達(dá)質(zhì)粒,利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),通過(guò)順序轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,篩選人腎cDNA文庫(kù),沒(méi)有找到相互作用蛋白,分析原因可能由于SseF蛋白結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)影響了其在酵母細(xì)胞中的定位,從而影響雙雜交結(jié)果,因此構(gòu)建了SseF的截短突變體釣餌表達(dá)質(zhì)粒再次篩選人腎cDNA文庫(kù),發(fā)現(xiàn)SseF能夠與宿主細(xì)胞乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用,這種相互作用進(jìn)一步經(jīng)pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了確定SseF與TIP60相互作用的功能域,構(gòu)建了一系列SseF的截短突變體,經(jīng)酵母雙雜交及pull-down實(shí)驗(yàn)表明SseF50-66足以和TIP60相互作用。 為了探討SseF和TIP60相互作用的分子機(jī)制,首先驗(yàn)證SseF是否作為TIP60的底物,構(gòu)建了SseF和TIP60的原核表達(dá)質(zhì)粒,利用組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)(histone acetyltranseferse assay, HAT assay)發(fā)現(xiàn)SseF能被TIP60乙�；揎�。組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶活性缺失突變的TIP60不能使SseF乙�；揎�。進(jìn)一步做點(diǎn)突變分析表明SseF第25位的賴氨酸是TIP60發(fā)生乙�；揎椀奶禺愋晕稽c(diǎn)。 為了探討SseF的乙酰化對(duì)其功能的影響,首先利用同源重組方法構(gòu)建了沙門氏菌染色體sseF全長(zhǎng)缺失突變株和潛在乙�；稽c(diǎn)點(diǎn)突變株,分別使用個(gè)突變株和野生株感染巨噬細(xì)胞,利用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算感染12小時(shí)后細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率,結(jié)果顯示,在染色體突變sseF潛在乙�；稽c(diǎn)后,發(fā)現(xiàn)沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率較野生株相比降低了約50%,此點(diǎn)突變株的表型與sseF全長(zhǎng)缺失突變株表型類似。這些數(shù)據(jù)提示SseF的乙�；揎椗c其功能的發(fā)揮密切相關(guān)；進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)降低宿主細(xì)胞TIP60的表達(dá)并觀察對(duì)沙門氏菌感染細(xì)胞后相關(guān)表型的影響,構(gòu)建了siRNATIP60干擾載體,并通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光確定了siRNATIP60干擾載體的感染效率。沙門氏菌分別感染干擾載體處理的Hela細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并觀察宿主細(xì)胞TIP60的表達(dá)對(duì)沙門氏菌感染相關(guān)表型的影響。結(jié)果顯示,降低宿主細(xì)胞中TIP60的表達(dá)后,沙門氏菌感染的Hela細(xì)胞內(nèi)觀察不到Sifs的形成,并且沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率顯著降低。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明沙門氏菌感染宿主細(xì)胞后,其分泌的效應(yīng)蛋白SseF通過(guò)與宿主細(xì)胞乙�；D(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用并被乙�；揎�,并且SseF的乙�；揎椗c其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。 綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)沙門氏菌感染宿主細(xì)胞后,其分泌的效應(yīng)蛋白SseF能夠與宿主細(xì)胞的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用并且被乙�；揎�,同時(shí)找到了被乙�；揎椀奈稽c(diǎn)。利用同源重組技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌染色體SseF基因點(diǎn)突變,進(jìn)一步研究表明SseF的乙�；揎椗c其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。以上研究豐富了對(duì)沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)及與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制的探討。該研究將促進(jìn)理解微生物與宿主相互作用的機(jī)制,為細(xì)胞微生物學(xué)的研究提供新思路。
[Abstract]:SseF and SseG play an important role in maintaining the integrity of SCV membrane and regulating the transport and localization of SCV . In order to find the target protein of SseF in the host cell , the full - length bait expression plasmid of SseF was constructed . The human kidney cDNA library was screened by means of yeast two - hybrid experiment . In order to investigate the molecular mechanism of SseF and TIP60 interaction , we first verify whether SseF is used as substrate of TIP60 , construct prokaryotic expression plasmids of SseF and TIP60 , and find that SseF can be modified by TIP60 acetylation . In order to investigate the effect of the acetylation of SseF on the function of Salmonella , we constructed a mutant strain of salmonella chromosome sseF and a mutant strain of potential acetylated site by homologous recombination . The results showed that the expression of TIP60 in the host cell was reduced by using RNA interference technique . The results showed that the expression of TIP60 in the host cell was reduced . The results showed that the effect protein SseF secreted by Salmonella was modified by the specific interaction with the host cell acetyl transferase TIP60 and the effect of SseF was closely related to the function of the cell . In conclusion , the effect protein SseF secreted by Salmonella is able to interact specifically with the histone acetyl transferase TIP60 of the host cell and is modified by acetylation at the same time . It also finds out that the acetylation modification of SseF is closely related to the function of host cell . The research enriches the mechanism of interaction between microorganism and host cell , and provides a new idea for the research of cell microbiology .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R378

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 睿中;綜合遺傳學(xué)公司推出食品沙門氏菌快速診斷試驗(yàn)盒[J];中國(guó)生物工程雜志;1986年02期

2 徐紹穎;;更有效的沙門氏菌疫苗[J];全球科技經(jīng)濟(jì)w，

本文編號(hào)：1430145