發(fā)布時間：2018-01-15 18:05

  本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞生長因子濃度對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的影響　出處：《鄭州大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景及目的 目前心血管疾病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一,尤其以心肌缺血性疾病(ischemic heart disease,IHD)最為常見,而心肌梗死(myocardialinfarction,MI)作為其中最為嚴(yán)重的一種類型是人們關(guān)注的焦點。目前,藥物、介入以及外科手術(shù)等心肌梗死的常用治療方法雖可使心臟閉塞的血管再通,改善心肌缺血和充血性心力衰竭(congestive heartfailure,CHF)的癥狀,但卻不能從根本上恢復(fù)心肌細(xì)胞數(shù)量,改善心臟舒縮功能。心臟移植雖可從根本上解決心室重構(gòu)問題,但因受到技術(shù)、供體來源、費(fèi)用以及社會、倫理道德等多種限制,目前尚無法廣泛應(yīng)用。 隨著組織工程學(xué)及干細(xì)胞研究的深入,干細(xì)胞的分離、純化以及體外定向分化的技術(shù)得到了很大程度地提高。通過誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞移植來代替壞死心肌細(xì)胞,理論上可能達(dá)到改善心功能的目的,為心梗的治療提供了一種新的研究方向。但并非任何干細(xì)胞都能擔(dān)當(dāng)這一角色,胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESs)和骨骼肌干細(xì)胞就被排除,前者由于來源及倫理問題應(yīng)用受限,而后者因為分化成熟后無法與宿主細(xì)胞建立電機(jī)械偶聯(lián)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體,主要存在于網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi),而且在體外特定的誘導(dǎo)條件下,可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等,還具有取材方便、連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能的優(yōu)點,并已有眾多研究證實其可用于自體移植。故而,誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞并將之通過細(xì)胞移植用于心肌梗死的治療目前已經(jīng)成為研究的熱點之一。 目前,誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化的研究主要集中于化學(xué)誘導(dǎo)分化,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)被證實是最有效化學(xué)制劑,但其誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率也始終低于20%～30%,且具有細(xì)胞毒性作用,臨床應(yīng)用受到極大地限制,這就使尋找更為合適的誘導(dǎo)劑成為研究的熱點。有研究認(rèn)為,某些細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth facto,HGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)等在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞定向分化中起著重要的作用,并有足夠的理論和實驗表明使用細(xì)胞因子作為誘導(dǎo)分化劑在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞可能具有重要的研究與應(yīng)用價值,而且相比5-氮胞苷等眾多已有研究的化學(xué)物質(zhì),細(xì)胞因子沒有細(xì)胞毒性作用,是較為理想的干細(xì)胞誘導(dǎo)劑。HGF是由間質(zhì)細(xì)胞分泌的一種多功能的細(xì)胞因子,它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和運(yùn)動,促進(jìn)多種細(xì)胞組織形態(tài)的發(fā)生等作用;它還是一種心肌營養(yǎng)因子,具有很強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂,修復(fù)內(nèi)皮損傷,抑制細(xì)胞凋亡與組織重構(gòu)的作用。 近年來MSCs向心肌細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)研究多局限于細(xì)胞培養(yǎng)、動物實驗,而人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Bone Marrow messenchymal Syem Cells,hMSCs)的體外分離、純化、定向誘導(dǎo)的研究報道尚少,關(guān)于HGF誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞分化的研究報道就更為鮮有。結(jié)合上述研究現(xiàn)狀,本研究選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)作為研究對象,采用密度梯度離心法及貼壁篩選法分離純化hMSCs,并在體外用不同濃度的HGF誘導(dǎo)分離純化后的hMSCs,旨在探討HGF是否能成功誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞分化以及HGF的濃度對MSCs的誘導(dǎo)作用是否有影響。 材料與方法: 1.標(biāo)本:骨髓來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科2007年～2008年非青紫型先天性心臟病患者,所有患者術(shù)前均排除血液系統(tǒng)疾病,并征得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。 2.處理:胸骨穿刺抽取骨髓3～5ml骨髓,肝素(100U/ml)抗凝后即送實驗室,按比例加入percoll分離液(密度1.073g/mL)行密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞,再利用貼壁篩選法純化hMSCs后,進(jìn)行原代傳代培養(yǎng)。 3.分組:取第3代傳代細(xì)胞,分為6組:①～⑤組為實驗組,分別加入3μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L HGF,連續(xù)培養(yǎng)4w,每3d換液1次;⑥組為陰性對照組,不加入HGF,其余條件與實驗組相同。 4.結(jié)果判定:所有分組均在顯微鏡下連續(xù)觀察誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化,并詳細(xì)記錄;再于第四周行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)及心肌特征性蛋白縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá),胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,用cTnI陽性細(xì)胞所占比例計算轉(zhuǎn)化率。 5.統(tǒng)計學(xué)方法:運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件,多個樣本均數(shù)的比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(H檢驗),組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗,取α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.顯微鏡下連續(xù)觀察結(jié)果:經(jīng)HGF誘導(dǎo)的各實驗組hMSCs均出現(xiàn)不同程度的增殖,誘導(dǎo)7d后hMSCs的形態(tài)即發(fā)生明顯改變,細(xì)胞緊密生長,體積明顯增大,紡錘形細(xì)胞比例下降,多為卵圓形或柱狀細(xì)胞,相鄰細(xì)胞間有接觸。2周后細(xì)胞之間連接愈加緊密。3～4周后,細(xì)胞增殖速度減慢,相鄰細(xì)胞間逐漸相連呈肌管狀,細(xì)胞核/胞漿比例明顯降低,胞漿內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu),且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍。陰性對照組hMSCs無任何明顯改變。 2.實驗4周后,用免疫組化法鑒定cTnI、Cx43:在陰性對照組上述兩蛋白均呈陰性表達(dá),而在經(jīng)HGF作用后的5個實驗組中均有一定的陽性表達(dá)。其中,cTnI陽性細(xì)胞百分率(%):3μg/L組為(14.24±0.46%)、5μg/L組為(25.32±1.41%)、10μg/L組為(38.46±1.41%)、20μg/L組為(27.38±1.32%)、40μg/L組為(20.36±2.15%),統(tǒng)計學(xué)分析各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),且以10μg/L組最高。 結(jié)論 1.hMSCs經(jīng)HGF誘導(dǎo)后的細(xì)胞間有肌管樣結(jié)構(gòu)形成,且存在cTnI、Cx43的陽性表達(dá),出現(xiàn)可鑒定為心肌細(xì)胞的特異性免疫組化表現(xiàn),提示HGF在體外能夠誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 2.不同濃度HGF誘導(dǎo)的hMSCs轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞百分率不同,而10μg/L HGF誘導(dǎo)組相對轉(zhuǎn)化率最高,提示HGF的濃度對其誘導(dǎo)效果有影響,且其最佳誘導(dǎo)濃度可能為10μg/L。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1429449