發(fā)布時(shí)間：2018-01-14 19:40

  本文關(guān)鍵詞：殘粒脂蛋白對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管新生的影響　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景與目的：內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)的數(shù)量和功能與血管內(nèi)皮功能明確相關(guān)。細(xì)胞復(fù)制性衰老是指細(xì)胞失去分化能力,同時(shí)發(fā)生相應(yīng)形態(tài)學(xué)改變和其它功能障礙。危險(xiǎn)因素通過(guò)氧化機(jī)制加速EPCs的衰老進(jìn)程。殘粒脂蛋白(Remnant lipoproteins, RLPs)可通過(guò)氧化機(jī)制直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮舒張功能損害和成熟內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的異常,但是還不清楚RLPs是否還影響EPCs衰老及其功能。本研究擬觀察RLPs對(duì)EPCs衰老、增殖、遷移、粘附和體外血管新生能力的影響。 方法： 采用已建立的高脂餐方案：總熱量為800千卡(脂肪50克、蛋白質(zhì)28克、碳水化合物60克),采集高甘油三酯血癥患者脂餐后4小時(shí)EDTA抗凝靜脈血標(biāo)本。應(yīng)用免疫親和層析法和密度梯度超速離心技術(shù)分離人血漿RLPs, BCA法測(cè)定RLPs的蛋白含量。密度梯度離心法分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞,利用添加生長(zhǎng)因子的M 199條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞貼壁向EPCs分化。流式細(xì)胞儀、雙熒光染色、直接免疫熒光染色和普通免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定EPCs。 1)將不同濃度(0-200μg/mL)的RLPs加入第10天的EPCs,分別培養(yǎng)6、12、24及48小時(shí)。采用衰老相關(guān)的p-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase, SA-β-Gal)染色技術(shù),在PH6的條件下,計(jì)數(shù)強(qiáng)SA-β-gal活性的EPCs,獲取RLPs影響EPCs衰老進(jìn)程的最大效應(yīng)濃度(CR)和最佳干預(yù)時(shí)間(TR)。 2)將培養(yǎng)第10天EPCs以添加CR濃度RLPs的M199條件培養(yǎng)液培養(yǎng)TR時(shí)間,再加入不同濃度(0.01-10μmol/L)的阿托伐他汀(Atorvastatin,ATR),分別培養(yǎng)6、12、24及48小時(shí)。采用SA-β-gal染色技術(shù),在PH6的條件下,計(jì)數(shù)強(qiáng)SA-β-gal活性的EPCs,獲取ATR影響EPCs衰老進(jìn)程的最大效應(yīng)濃度(CA)和最佳干預(yù)時(shí)間(TA)。 3)分為空白對(duì)照組、RLPs刺激組、ATR干預(yù)組和RLPs刺激+ATR干預(yù)組。將濃度為CR的RLPs、濃度為CA的ATR和對(duì)照物于細(xì)胞培養(yǎng)第10天加入EPCs,分別作用相應(yīng)時(shí)間。采用SA-β-gal染色技術(shù),在PH6的條件下,計(jì)數(shù)強(qiáng)SA-β-gal活性的EPCs,檢測(cè)各干預(yù)措施對(duì)EPCs衰老的影響。 4)觀察RLPs對(duì)EPCs功能的影響 分為空白對(duì)照組、RLPs刺激組、ATR干預(yù)組和RLPs刺激+ATR干預(yù)組。將濃度為CR的RLPs、濃度為CA的ATR和對(duì)照物于細(xì)胞培養(yǎng)第10天加入EPCs,分別作用相應(yīng)時(shí)間。①改良的Boyden小室評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力。②粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞粘附能力。③MTT比色法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。④Matrigel成血管網(wǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)EPCs在體外的血管新生能力。 結(jié)果： (1)外周血單個(gè)核細(xì)胞用添加生長(zhǎng)因子的M199條件培養(yǎng)基培養(yǎng)可誘導(dǎo)分化成EPCs,具備典型的形態(tài)學(xué)和表型特征； (2)從高甘油三酯血癥患者靜脈血中制得RLPs,經(jīng)BCA法測(cè)定的RLPs蛋白濃度值為4.28±0.36mg/mL; (3) RLPs的最大效應(yīng)濃度為100μg/mL,最佳干預(yù)時(shí)間為24小時(shí)；ATR的最大效應(yīng)濃度為1.0μmol/L,最佳干預(yù)時(shí)間為24小時(shí)； (4) RLPs刺激能使EPCs的SA-β-Gal活性增加,EPCs衰老細(xì)胞數(shù)增加,其遷移、粘附、增殖和形成微血管網(wǎng)的能力顯著降低； (5)ATR治療可以降低EPCs的SA-β-Gal活性,顯著減少EPCs衰老細(xì)胞數(shù),增強(qiáng)其遷移、粘附、增殖和形成微血管網(wǎng)的能力。 結(jié)論：RLPs可以導(dǎo)致EPCs衰老并抑制其血管新生的相關(guān)功能,ATR治療可以改善RLPs對(duì)EPCs的上述負(fù)面影響。 背景與目的：裸鼠后肢缺血模型是目前國(guó)際上最常采用的用于評(píng)價(jià)EPCs移植治療效果的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。采用裸鼠后肢缺血模型,通過(guò)移植DAPI標(biāo)記的EPCs,并運(yùn)用免疫組化技術(shù)、細(xì)胞衰老生物標(biāo)記染色技術(shù)和激光多普勒血流成像技術(shù),觀察RLPs對(duì)EPCs移植后裸鼠缺血后肢血運(yùn)重建的影響。 方法： 參照Heeschen等的方法(Circulation,2004;109:1615-22),應(yīng)用8-10周齡BALB/c雄性裸鼠建立后肢缺血裸鼠模型,缺血手術(shù)24小時(shí)后,以PBS液作對(duì)照,由尾靜脈注入體外擴(kuò)增培養(yǎng)10天且經(jīng)DAPI熒光標(biāo)記的EPCs至裸鼠體內(nèi)。于EPCs移植第1天開始,每間隔48小時(shí)經(jīng)由尾靜脈注入RLPs或?qū)φ瘴�；同時(shí)根據(jù)ATR應(yīng)用情況,將裸鼠分為：對(duì)照組、RLPs刺激組、ATR干預(yù)組、RLPs刺激+ATR干預(yù)組。激光多普勒血流掃描儀監(jiān)測(cè)后肢的血液灌流情況。21天后,處死裸鼠,取缺血后肢與正常后肢腓腸肌做病理切片。免疫組化法檢測(cè)缺血組織的新生微血管密度和EPCs的組織分布情況。采用SA-β-gal染色技術(shù),在PH6的條件下,計(jì)數(shù)強(qiáng)SA-β-gal活性的血管數(shù)目。 結(jié)果： (1)成功建立裸鼠后肢缺血模型,缺血后肢末梢循環(huán)、運(yùn)動(dòng)功能、血流灌注情況隨時(shí)間發(fā)生規(guī)律改變,組織病理學(xué)改變符合缺血特征； (2) EPCs移植可以顯著降低缺血后肢的傷殘率； (3) RLPs刺激組的EPCs組織分布數(shù)、新生毛細(xì)血管密度和缺血后肢血流灌注要顯著低于其他各組,可以觀察到新生血管的衰老現(xiàn)象； (4)ATR治療組的EPCs組織分布數(shù)、新生毛細(xì)血管密度和缺血后肢血流灌注要顯著高于其他各組。 結(jié)論：RLPs通過(guò)刺激EPCs衰老而抑制其在體內(nèi)的血管新生能力,ATR治療可以改善EPCs受損的血管新生能力。 背景與目的：微小RNA(microRNA, miRNA)是新近證明的一類高度保守的、內(nèi)源性非蛋白編碼的長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小分子RNA,參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞的血管新生,參與調(diào)控細(xì)胞衰老。通過(guò)對(duì)RLPs干預(yù)體外培養(yǎng)EPCs的研究,利用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)相關(guān)miRNA的改變情況,以初步了解miRNA是否參與調(diào)控RLPs對(duì)EPCs血管新生的影響。 方法： 取培養(yǎng)第10天EPCs,分為RLPs干預(yù)組和對(duì)照組,采用Agilent的人microRNA寡核苷酸基因芯片尋找顯著差異表達(dá)的miRNA,構(gòu)建RLPs干預(yù)組和對(duì)照組的miRNA表達(dá)譜：用mirVana RNA Isolation Kit提取兩組EPCs的總RNA并進(jìn)行純化；使用Nanodrop分光光度計(jì)(NP-1000)測(cè)定RNA在260nm和280nm波長(zhǎng)的吸收值,計(jì)算樣本總RNA濃度并評(píng)估純度；采用Agilent RNA 6000 Nano Assay檢測(cè)RNA純度及完整性；采用Agilent's miRNA Complete Labeling and Hyb Kit進(jìn)行：miRNA熒光標(biāo)記和芯片雜交；采用Agilent's Gene Expression Wash Buffer Kit進(jìn)行雜交芯片的洗脫；使用Agilent Microarray Scanner掃描芯片的熒光強(qiáng)度并借助Agilent Feature Extraction Software提取原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算,篩選兩組間差異表達(dá)顯著的miRNA。 結(jié)果： 與對(duì)照組相比,EPCs經(jīng)RLPs干預(yù)后顯著異常表達(dá)的miRNA共有4個(gè),顯著上調(diào)表達(dá)miRNA有3個(gè),分別為：hsa-miR-148b*、hsa-miR-155*和hsa-miR-513c;一個(gè)顯著下調(diào)的miRNA,即hsa-miR-574-3p。 結(jié)論：miRNA可能參與調(diào)控RLPs對(duì)EPCs血管新生的影響。
[Abstract]:Background and objective: endothelial progenitor cells (Endothelial Progenitor Cells, EPCs) the number and function of endothelial function and clear. Cell replicative senescence refers to cells lose the ability of differentiation, and corresponding morphological changes and other dysfunction. Risk factors through the oxidation mechanism of EPCs accelerated aging process. Remnant lipoprotein (Remnant lipoproteins. RLPs) by oxidation mechanism directly leads to abnormal vascular endothelial function damage and mature endothelial cells, but it is not clear whether RLPs also affects EPCs senescence and function. This study intends to observe the effect of RLPs on EPCs proliferation, senescence, migration, adhesion and angiogenesis in vitro ability.
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本文編號(hào)：1425054