本文關鍵詞：NOV基因真核表達載體的構建及其在大鼠真皮多能干細胞成神經(jīng)分化中的作用研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的損傷修復一直是困擾神經(jīng)科學工作者的大難題。傳統(tǒng)觀念認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一旦損傷便不能恢復。近20年來隨著神經(jīng)科學的發(fā)展,尤其是干細胞的出現(xiàn)使人們觀念發(fā)生改變,逐漸認識到成年CNS再生是由神經(jīng)元的固有特性(intrinsic properties)和其所處的環(huán)境(environmental cues)共同決定的。因此增加受損神經(jīng)元的再生潛能,改善軸突再生的微環(huán)境成為CNS損傷修復的基點。 神經(jīng)損傷后修復的難點之一是神經(jīng)元再生困難,近年來隨著干細胞研究的迅猛發(fā)展,組織和細胞移植治療成為大家最為關注的方法之一。選擇合適的種子細胞是細胞移植最核心的問題。目前用于移植的細胞供體主要是胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSC)、來源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有促神經(jīng)再生作用的細胞(如神經(jīng)膜細胞、少突膠質(zhì)細胞、嗅鞘細胞等),以及其他具有成神經(jīng)分化潛能的成體干細胞。盡管這些細胞在CNS損傷修復移植治療中均顯示出不同程度的積極作用,但由于細胞來源局限、取材不易、免疫排斥以及倫理道德等諸多方面的問題,臨床應用受到很大限制。因此,尋找新的種子細胞來源成為當務之急。皮膚是人體最大的器官,包括來源于三個胚層的多種不同的組織細胞,自我更新和再生修復速度快,是成體干細胞分離和研究的良好對象。真皮多能干細胞(Dermal multipotent stem cells,DMSCs)是一種新近分離成功的具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞,具有分化為脂肪細胞、肌細胞及神經(jīng)細胞的能力。相對于其他移植供體細胞而言,DMSCs具有來源豐富、容易獲得、可自體移植、具有更少的“譜系傾向性”等優(yōu)點。避免了胚胎倫理學、來源不足、異體排斥等弊端。更有研究表明,DMSCs移植治療脊髓損傷時,不僅能外在補充缺失神經(jīng)元,同時可通過分化產(chǎn)生Schwann cells促進軸突再生及髓鞘化。顯示了DMSCs在CNS損傷修復中的良好應用前景,有望成為細胞移植及組織工程的新寵。 在神經(jīng)損傷修復中,除細胞移植外在補充缺失神經(jīng)元外,利用基因工程方法改善損傷局部微環(huán)境是治療的另一個側重點。腎母細胞瘤過度表達基因(Nephroblastoma Overexpression gene,NOV)是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)相關蛋白(IGF-relation proteins, IGF-rPs ),屬于IGF超家族的成員。NOV基因是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個調(diào)控因子,與動物CNS的損傷和修復之間存在一定的關系。NOV基因可通過IGF依賴或者非依賴的方式發(fā)揮作用,參與CNS損傷后的再生和修復過程。NOV基因的真核表達載體可以表達和釋放NOV蛋白,促進內(nèi)源和外源性NSC向神經(jīng)元的分化,為CNS再生修復提供合適的微環(huán)境。NOV基因及其蛋白對DMSCs是否具有類似作用尚未見相關報道。 擬將DMSCs作為種子細胞攜載NOV基因進入體內(nèi),不但能外在補充CNS損傷中缺失的神經(jīng)元,同時在體發(fā)揮改善損傷局部微環(huán)境的生物學效應,結合NOV基因治療及DMSCs細胞移植治療雙重優(yōu)勢用于CNS的損傷修復,是本實驗的基本設計思路。為此本文進行了如下研究:(1)含NOV基因的全長序列的真核表達載體的構建和表達;(2)大鼠真皮來源多能干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定;(3)觀察NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs增殖和成神經(jīng)分化的影響。通過該項研究為結合NOV基因工程及DMSCs細胞移植用于CNS的損傷修復治療提供初步離體實驗資料。 研究的主要結果及結論概述如下: 1、利用RT-PCR的產(chǎn)物,采用定向克隆的方法,通過中間載體pMD-19T,成功地將NOV cDNA全長序列克隆到pEGFP-N1真核表達質(zhì)粒上,構建了pEGFP-N1/NOV融合表達載體,用抗性菌落篩選、質(zhì)粒酶切鑒定、插入片段序列分析等方法,證明獲得的重組質(zhì)粒完全符合設計要求,為進一步的NOV基因功能研究提供分子平臺。 2、利用早期貼壁傳代培養(yǎng)方法,從新生大鼠真皮中分離培養(yǎng)多能干細胞,該細胞經(jīng)流式細胞儀檢測細胞周期、MTT法測定生長曲線具有良好的自我增殖能力;在一定誘導條件下分化為神經(jīng)細胞、脂肪細胞及成骨細胞,具有向外胚層及中胚層細胞分化的多能性。由此證實了大鼠真皮組織中存在著間充質(zhì)干細胞,為干細胞移植治療提供了又一新的種子細胞來源。 3、在構建了NOV基因真核表達載體的基礎上,用脂質(zhì)體轉染法首次將該重組質(zhì)粒轉染入DMSCs中,流式細胞儀檢測轉染效率約30%。經(jīng)G418篩選陽性克隆、多次傳代純化后用RT-PCR法檢測到NOV重組質(zhì)粒在DMSCs中穩(wěn)定表達。表明DMSCs可作為NOV基因的細胞載體。 4、通過細胞形態(tài)學觀察、流式細胞儀及MTT法研究NOV基因轉染對DMSCs增殖性的影響,發(fā)現(xiàn)轉染了NOV基因的DMSCs較對照組細胞G0/G1期細胞比例下降,細胞倍增時間提前,增殖能力提高一倍。提示NOV基因能刺激DMSCs的增殖。 5、收集培養(yǎng)NOV/DMSCs細胞的條件培養(yǎng)液(NOV-CM),結合細胞形態(tài)學變化及免疫細胞化學法,研究NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs分化的影響,結果顯示NOV-CM可以促進DMSCs向神經(jīng)元方向分化,分化細胞中神經(jīng)元比例增高,且細胞突起較對照組明顯延長。NOV基因轉染亦具有同樣的作用。 綜上所述,我們準確的構建了含NOV基因全長序列的真核表達載體,成功分離、培養(yǎng)并鑒定了新生大鼠真皮多能干細胞。在此基礎上,采用脂質(zhì)體法首次將該重組質(zhì)粒轉染至DMSCs中,并且NOV基因在其中穩(wěn)定表達。進一步的研究表明NOV基因及其分泌蛋白可以顯著提高DMSCs增殖性、促進DMSCs向神經(jīng)元方向分化并有助于突起形成。該實驗結果提示DMSCs不僅可作為一種新的種子細胞來源,且攜載了NOV基因的DMSCs具有細胞移植及基因工程雙重優(yōu)勢,不但外在補充缺失神經(jīng)元,同時可改善損傷局部微環(huán)境,有望在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復中發(fā)揮作用。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻】

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1 席照房;ARC及IGF-1在AS肉雞中抗心肌細胞凋亡作用的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

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本文編號：1423208