本文關(guān)鍵詞：碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷海馬空間和條件學(xué)習(xí)記憶及其CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制研究　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 碘是人體必不可少的微量元素之一,是甲狀腺激素合成的重要原料,并影響甲狀腺激素的合成與分泌。甲狀腺激素是正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的激素,具有促進(jìn)組織分化、生長(zhǎng)與發(fā)育成熟的作用,對(duì)腦的發(fā)育尤為重要。海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū),對(duì)甲狀腺激素敏感。在發(fā)育的關(guān)鍵期,短暫的甲狀腺激素缺乏,會(huì)導(dǎo)致海馬區(qū)域神經(jīng)系統(tǒng)功能上的破壞和不可逆性的損傷,對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)育以及突觸可塑性產(chǎn)生極大的影響,嚴(yán)重的甲狀腺激素缺乏可導(dǎo)致被動(dòng)躲避、空間學(xué)習(xí)和操作式條件反射受損。鈣離子-鈣調(diào)蛋白-鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶途徑(以下簡(jiǎn)稱為CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)和腺苷酸環(huán)化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶途徑(以下簡(jiǎn)稱為MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)是在學(xué)習(xí)與記憶形成過(guò)程中重要的第二信使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。在腦發(fā)育過(guò)程中碘缺乏和甲狀腺功能減退如何影響學(xué)習(xí)記憶形成及CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚,其對(duì)海馬CA1、CA3和DG區(qū)的影響作用如何也有待研究。我們采用碘缺乏飼料和不同劑量的PTU飲水建立碘缺乏和甲狀腺功能減退模型,研究仔鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn),及學(xué)習(xí)記憶前后海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變,以在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白分子水平上闡明碘缺乏和甲狀腺功能減退損害神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康2月齡雌性Wistar大鼠,交配妊娠后,取孕鼠28只,按體重隨機(jī)分成對(duì)照組、5 ppm組、15ppm組和碘缺乏組,每組7只孕鼠。自GD6起,碘缺乏組飼以缺碘地區(qū)糧食配制的飼料,飲用自來(lái)水;5ppm組和15ppm組孕鼠分別給予5 ppm和15ppm PTU飲水,普通飼料,至仔鼠PN28時(shí)恢復(fù)正常飼料和飲水。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,測(cè)定母鼠及仔鼠體重,觀察仔鼠開(kāi)眼情況 2、血清TSH、TH測(cè)定 分別于PN14、PN21、PN28和PN42時(shí),取仔鼠心臟采血,3000rpm離心5min,分離血清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測(cè)定血清中TSH、FT_3和FT_4含量。 3、仔鼠海馬重量測(cè)定 分別于PN14、PN21、PN28和PN42時(shí)每組取3只仔鼠,乙醚麻醉后斷頭,取腦,剝離雙側(cè)海馬,稱重。 4、海馬CA1、CA3和DG區(qū)免疫組織化學(xué)蛋白表達(dá)分析 分別于PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)每組取5只仔鼠,4%多聚甲醛灌流固定大腦,石蠟包埋,切片。免疫組織化學(xué)染色,觀察海馬CA1、CA3和DG區(qū)總CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、總ERK1/2、p-ERK1/2、總CREB、p-CREB的免疫表達(dá)。用圖象分析系統(tǒng)及圖象分析軟件分析海馬CA1、CA3和DG區(qū)各蛋白表達(dá)的總積分光密度。 5、海馬CA1、CA3和DG區(qū)western blot蛋白測(cè)定分析 分別于PN14、PN21和PN28時(shí),每組選取3只仔鼠,斷頭取腦,剝離海馬,分離CA1、CA3和DG區(qū),采用western blot方法分別測(cè)定海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaM、總CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、總ERK1/2、p-ERK1/2、總CREB、p-CREB的蛋白。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)照相,測(cè)得各條帶的凈光密度值。 6、水迷宮實(shí)驗(yàn) 在PN30時(shí),將仔鼠置于水迷宮,了解安全臺(tái)階的存在后,將其放于起點(diǎn),自由游泳,記錄其進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)以及爬上安全臺(tái)階的時(shí)間(即潛伏期)。訓(xùn)練3天后,自第4天起,將仔鼠置于迷宮最遠(yuǎn)端作為游泳起點(diǎn),記錄2分鐘內(nèi)仔鼠進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期,進(jìn)行分析。 7、穿梭箱實(shí)驗(yàn) 在PN37時(shí),將仔鼠放入穿梭箱中,給予10s峰鳴刺激,仔鼠若完成穿梭,則該次循環(huán)結(jié)束,稱為主動(dòng)逃避;若未完成,則給予10s電擊刺激,使其完成穿梭,相應(yīng)的電擊結(jié)束,稱為被動(dòng)逃避。如此反復(fù)循環(huán)10次。共記錄6天的結(jié)果,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 8、學(xué)習(xí)記憶過(guò)程影響CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的測(cè)定 在穿梭箱實(shí)驗(yàn)完成后(即PN42時(shí)),立刻每組隨機(jī)取5只仔鼠,灌流固定,石蠟包埋、切片后,免疫組織化學(xué)染色,觀察海馬CA1、CA3和DG區(qū)Ca~(2+)和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各蛋白的免疫表達(dá)。每組隨機(jī)取3只仔鼠,斷頭取腦,剝離海馬,分離CA1、CA3和DG區(qū)后,采用western blot方法分別測(cè)定海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各蛋白的水平。 9、統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果表示為mean±S.E.M.。全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),用SNK進(jìn)行組間比較。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較PN28和PN42間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、母鼠和仔鼠體重及仔鼠海馬重、開(kāi)眼率結(jié)果 碘缺乏與甲狀腺功能減退可影響母鼠和仔鼠體重,孕期和哺乳期碘缺乏組母鼠體重明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);5ppm組、15ppm組和碘缺乏組仔鼠體重增長(zhǎng)緩慢,海馬重量減輕,均顯著低于正常水平(P＜0.05)。15ppm組和碘缺乏組仔鼠開(kāi)眼延遲,同期開(kāi)眼率明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。 2、TSH和TH水平 甲狀腺功能減退可通過(guò)反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)TSH分泌增多,FT_3和FT_4水平下降。在PN14、PN21和PN28時(shí),與對(duì)照組相比,5ppm組和15ppm組TSH水平顯著升高(P＜0.05),碘缺乏組無(wú)明顯變化;15ppm組和碘缺乏組的FT_3和FT_4水平明顯下降(P＜0.05)。停用PTU和碘缺乏飼料后(PN42),TSH和TH水平均恢復(fù)正常。 3、海馬CA1、CA3和DG區(qū)免疫組織化學(xué)蛋白表達(dá)結(jié)果 PN14、PN21和PN28時(shí),在CA1和CA3區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、Ng、BDNF、ERK1/2和CREB表達(dá)顯著低于對(duì)照組,CaN的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、CaN、BDNF和CREB表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),而Ng和ERK1/2與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。PN7時(shí),各區(qū)均幾乎觀察不到陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物,各組間蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。 4、海馬CA1、CA3和DG區(qū)western blot蛋白測(cè)定結(jié)果 在CA1和CA3區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaM、Ng、BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB蛋白水平顯著低于對(duì)照組,CaN則高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、CaN、BDNF、CREB和p-CREB蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),而p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2和p-ERK1/2與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。 5、神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果 在水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試期,15ppm組和碘缺乏組仔鼠的潛伏期和進(jìn)入各盲端的錯(cuò)誤次數(shù)明顯多于對(duì)照組和5ppm組;在穿梭箱實(shí)驗(yàn)第3-6天,15ppm組和碘缺乏組遭電擊次數(shù)、主動(dòng)和被動(dòng)回避時(shí)間明顯多于對(duì)照組與5ppm組,均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 6、學(xué)習(xí)記憶過(guò)程對(duì)CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 在神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后,對(duì)照組除CaN明顯下降外,其余各蛋白的表達(dá)水平均顯著上升(P＜0.05);15ppm組和碘缺乏組在CA1和CA3區(qū)各蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,但仍明顯低于對(duì)照組,而CaN顯著高于對(duì)照組,具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組CaN明顯降低,p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表達(dá)均顯著高于神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前。 結(jié)論 1、碘缺乏和甲狀腺功能減退可影響大鼠仔鼠發(fā)育,使其體重下降,海馬重量減輕,開(kāi)眼延遲。 2、碘缺乏和甲狀腺功能減退可增加海馬CA1和CA3區(qū)CaN活性,下調(diào)CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平;在DG區(qū),碘缺乏和甲狀腺功能減退不影響p-CaMKⅡ、CaM和Ng的蛋白表達(dá)。 3、碘缺乏和甲狀腺功能減退可下調(diào)海馬CA1和CA3區(qū)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平;在DG區(qū),碘缺乏和甲狀腺功能減退不影響ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)。 4、碘缺乏和甲狀腺功能減退可損傷仔鼠空間和條件學(xué)習(xí)記憶,使其找到安全區(qū)域的潛伏期及主動(dòng)和被動(dòng)躲避時(shí)間延長(zhǎng),進(jìn)入迷宮盲端的錯(cuò)誤次數(shù)和遭電擊次數(shù)增加。與神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前相比,海馬CA1和CA3區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平無(wú)明顯變化,DG區(qū)p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表達(dá)均顯著升高,CaN表達(dá)下降。 5、碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷仔鼠空間和條件學(xué)習(xí)記憶形成的機(jī)制可能是由于其增加海馬CA1和CA3區(qū)CaN活性,下調(diào)CaMKⅡ和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平,從而損傷神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性,影響正常腦發(fā)育和神經(jīng)回路的形成,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

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5 張艷青;甲狀腺素和維生素E干預(yù)對(duì)甲狀腺功能減退大鼠認(rèn)知能力的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

6 王茜;成年期甲狀腺功能減退大鼠前額葉突觸結(jié)合蛋白-Ⅰ表達(dá)及T_4替代治療作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

7 王偉;碘化鉀和碘酸鉀對(duì)碘缺乏大鼠晶狀體影響的對(duì)比研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2003年

8 戴紅;不同碘攝入量社區(qū)甲狀腺功能減退癥的流行病學(xué)隨訪研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2005年

9 盧亞男;2型糖尿病冠心病患者甲狀腺功能減退時(shí)血清脂聯(lián)素水平變化的特點(diǎn)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

10 張玉蘭;亞臨床甲狀腺功能減退癥孕期篩查與處理研究[D];暨南大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：1417387