本文關(guān)鍵詞：白念珠菌形態(tài)、胞壁多糖的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性的相關(guān)研究　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 第一部分白念珠菌形態(tài)變化相關(guān)機(jī)制的研究 第一節(jié)單個氨基酸對白念珠菌菌絲形成的影響 目的初步探討單個氨基酸對白念珠菌菌絲形成的影響。方法用0.67%的酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基和2%葡萄糖配制成SD合成培養(yǎng)基,37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng),研究單個天然氨基酸對白念珠菌形態(tài)學(xué)的影響,并分別通過不添加碳源和厭氧條件下培養(yǎng)觀察對精氨酸誘導(dǎo)的菌絲形成的影響。結(jié)果在含10mmol/L的L-精氨酸的SD液體培養(yǎng)基中,可見大量的菌絲。在含10mmol/L的L-半胱氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸和L-色氨酸的SD液體培養(yǎng)基中,可見典型的酵母細(xì)胞,未見菌絲。在含10mmol/L的其他單個氨基酸的SD液體培養(yǎng)基中可見混合的酵母和菌絲結(jié)構(gòu)。在不含氨基酸或含各種天然氨基酸的SD固體培養(yǎng)基上,白念珠菌的菌落均光滑。但在含10mmol/L的L-精氨酸固體培養(yǎng)基上,光滑的菌落周圍可見小的突起,鏡下可見菌絲。無氧條件下,無論有無碳源,含精氨酸的SD培養(yǎng)液中白念珠菌只能形成酵母細(xì)胞,生長部分受到抑制。結(jié)論精氨酸可以誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成,厭氧條件下精氨酸不能誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成。 第二節(jié)pH及氧氣對白念珠菌菌絲形成的影響 目的探討不同pH值和氧氣對白念珠菌菌絲形成的影響。方法通過調(diào)節(jié)Muller-Hinton液體培養(yǎng)基的pH值和去除培養(yǎng)基中的氧氣來觀察白念珠菌的生長曲線,倍增時間和菌絲形成率的變化。結(jié)果在無氧氣的液體培養(yǎng)基中,白念珠菌生長緩慢,不能產(chǎn)生菌絲,只有酵母細(xì)胞形成。生長曲線的延緩期內(nèi)各組沒有明顯差異,而在生長的對數(shù)期pH3和pH4的條件下念珠菌生長速度明顯慢于pH5、pH6、pH7、pH8和pH9。菌絲形成率在pH3、pH4和pH5條件下不到20%,而在pH6、pH7、pH8和pH9條件下可高達(dá)70%。結(jié)論厭氧條件抑制白念珠菌的菌絲形成。白念珠菌在pH 3～9的范圍內(nèi)均能生長,偏酸性環(huán)境有利于白念珠菌酵母形成,偏堿性的環(huán)境有助于菌絲的形成。 第三節(jié)電子傳遞鏈對白念珠菌菌絲形成的影響 目的探討電子傳遞鏈對白念珠菌菌絲形成的影響。方法用含10%小牛血清的RPMI1640在5%CO_2 37℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成,通過加用電子傳遞鏈的抑制劑和激動劑,觀察白念珠菌菌絲形成的影響、生長曲線和菌絲形成率。MTT法檢測對白念珠菌的抑制率。結(jié)果氯仿和二甲基亞砜的溶媒對照與空白對照之間對白念珠菌的生長和菌絲形成的影響無差異。噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)和苯甲羥肟酸作用于白念珠菌24h后細(xì)胞形態(tài)以酵母為主。魚藤酮、抗霉素A、寡霉素、疊氮鈉、TTFA和丙二酸鈉鹽與對照組比較在白念珠菌生長的對數(shù)期顯著抑制白念珠菌的生長(P＜0.01)。苯甲羥肟酸作用于白念珠菌后顯著抑制白念珠菌的生長,以生長對數(shù)期的抑制具有顯著的差異性(P＜0.01)。魚藤酮、抗霉素A、寡霉素、疊氮鈉、TTFA、丙二酸鈉鹽、苯甲羥肟酸和鳥苷酸鈉作用于白念珠菌12h的菌絲形成率分別為87.49±0.52、48.75±4.44、50.33±8.50、99.00±1.00、1.60±0.53、94.01±0.99、0.00±0.00和92.33±2.08。MTT法檢測魚藤酮、抗霉素A、寡霉素、疊氮鈉、TTFA、丙二酸鈉鹽、苯甲羥肟酸和鳥苷酸鈉對白念珠菌的抑制率分別為1.34±0.15、70.61±1.02、50.63±5.38、17.80±7.89、45.17±1.27、10.75±3.62、72.46±1.14和-(5.96±4.07)。加用抗霉素A、寡霉素、苯甲羥肟酸和TTFA后白念珠菌細(xì)胞內(nèi)GSSG/GSH明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論經(jīng)典呼吸鏈和替代途徑電子傳遞鏈的抑制劑能不同程度抑制白念珠菌的菌絲形成,替代氧化途徑是白念珠菌菌絲形成的主要途徑,可能與白念珠菌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力有關(guān)。 第四節(jié)溫度和二氧化碳對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響及其致病性差異的初步研究 目的探討溫度和二氧化碳對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響及其致病性差異。方法通過調(diào)整溫度和二氧化碳的濃度觀察白念珠菌的在含熒光桃紅B的改良Lee培養(yǎng)基上WO形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換,并通過與單核巨噬細(xì)胞THP-1共培養(yǎng),觀察單核巨噬細(xì)胞THP-1胞內(nèi)和胞外殺傷白念珠菌WO兩種形態(tài)的差異。結(jié)果在0.03%CO_2 25℃、0.03%CO_2 37℃和5%CO_2 37℃三種培養(yǎng)條件下,白念珠菌W→O轉(zhuǎn)換的O菌落占總菌落數(shù)的比例分別為0.572±0.087、0.920±0.030和0.985±0.026(P＜0.05)。在0.03%CO_225℃、0.03%CO_2 37℃和5%CO_2 37℃三種培養(yǎng)條件下,白念珠菌O→W轉(zhuǎn)換的O菌落占總菌落數(shù)的比例分別為0.60±0.114、0.983±0.003和0.998±0.003(P＜0.05)。THP-1細(xì)胞的細(xì)胞外殺O相白念珠菌活性為87.07%±1.80%,THP-1細(xì)胞的細(xì)胞外抗W相白念珠菌活性為62.98%±5.02%。THP-1細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)殺W相和O相白念珠菌活性在1:20和1:100兩個稀釋度均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)論白念珠菌W向O轉(zhuǎn)換的過程中,37℃有利于WO轉(zhuǎn)換,而且5%的CO_2濃度能更進(jìn)一步促進(jìn)白念珠菌的WO轉(zhuǎn)換。白念珠菌O向W轉(zhuǎn)換的過程中,37℃有利于維持白念珠菌的O狀態(tài),而且5%的CO_2濃度能更進(jìn)一步維持白念珠菌的O狀態(tài)。單核巨噬細(xì)胞對O相白念珠菌的殺傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于W相白念珠菌。 第二部分白念珠菌菌絲相和酵母相細(xì)胞壁甘露聚糖和不溶性葡聚糖的分離和純化、物化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析 第一節(jié)白念珠菌菌絲相和酵母相甘露聚糖的分離純化、物化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析 目的分離純化白念珠菌菌絲相和酵母相細(xì)胞壁甘露聚糖并進(jìn)行物化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析。方法通過37℃恒溫RPMI1640培養(yǎng)體外獲得白念珠菌菌絲相,通過37℃恒溫SDB培養(yǎng)體外獲得白念珠菌酵母相。稀堿法提取粗多糖,透析和過陰離子交換柱層析純化,改良苯酚硫酸法收集洗脫液,合并主糖峰管。高效凝膠過濾色譜、糖組成分析、甲基化分析和核磁共振進(jìn)行物化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果從菌絲相和酵母相白念珠菌細(xì)胞壁各獲得一個甘露聚糖純品,高效凝膠過濾色譜上呈對稱性單峰,分子量分別為23KD和30KD。甲基化分析顯示這二者均具有位于非還原末端甘露糖和1,2-,1,3-,1,2,6-連接的甘露糖基。核磁共振顯示以α-構(gòu)型為主,存在β-構(gòu)型的甘露糖基。結(jié)論菌絲相和酵母相的甘露聚糖結(jié)構(gòu)為以1,6-連接的甘露聚糖為主鏈,在2-O上有1,2-連接和1,3-連接甘露糖構(gòu)成的支鏈,酵母相甘露聚糖1,2-連接的甘露糖支鏈更長。 第二節(jié)白念珠菌菌絲相和酵母相不溶性葡聚糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析 目的分離純化白念珠菌菌絲相和酵母相細(xì)胞壁不溶性葡聚糖并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。方法通過37℃恒溫RPMI1640培養(yǎng)體外獲得白念珠菌菌絲相,通過37℃恒溫SDB培養(yǎng)體外獲得白念珠菌酵母相。采用氫氧化鈉、鹽酸和乙醇提取白念珠菌的細(xì)胞壁不溶性葡聚糖,硫酸化后變成可溶性葡聚糖,同時進(jìn)行單糖組成分析、甲基化分析以及核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果從菌絲相和酵母相白念珠菌細(xì)胞壁各獲得一個不溶性葡聚糖純品。甲基化分析顯示僅有1,3-連接的葡聚糖。核磁共振顯示為β-構(gòu)型的葡聚糖。結(jié)論白念珠菌菌絲相和酵母相的不溶性葡聚糖連接結(jié)構(gòu)均為β,1-3連接的葡聚糖,二者在葡聚糖的組成、連接鍵方式和構(gòu)型方面一致。 第三部分真菌胞壁多糖誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP-1免疫應(yīng)答機(jī)制的初步研究 目的探討真菌胞壁多糖誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP-1免疫應(yīng)答機(jī)制。方法通過RT-PCR檢測Dectin-1和TNF-a mRNA的表達(dá),ELISA和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分泌TNF-a和細(xì)胞膜Dectin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果Zymosan可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP-1的Dectin-1和TNF-a mRNA的表達(dá),滅活菌絲相、滅活酵母相、Zymosan、菌絲相甘露聚糖、酵母相甘露聚糖和不溶性葡聚糖均能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP-1分泌TNF-a,均呈劑量依賴性和時間依賴性。滅活菌絲相、滅活酵母相、Zymosan和不溶性葡聚糖均能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP-1的Dectin-1蛋白表達(dá),呈時間依賴性,加用Laminarin后Dectin-1蛋白表達(dá)減弱。結(jié)論滅活白念珠菌酵母相比滅活白念珠菌能更強(qiáng)地誘導(dǎo)THP-1分泌TNF-a。白念珠菌酵母相胞壁甘露聚糖比菌絲相胞壁甘露聚糖能更強(qiáng)地誘導(dǎo)THP-1分泌TNF-a。Zymosan和不溶性葡聚糖通過Dectin-1介導(dǎo)THP-1分泌TNF-a。
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【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R379

【引證文獻(xiàn)】

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1 王淼淼;臨床常見致病念珠菌的快速鑒定和近平滑念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換觀察[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：1412604