本文關(guān)鍵詞：大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α基因載體的構(gòu)建及對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 脊髓缺血損傷(Spinal Cord Ischemia Injury,SCII)是由各種原因引起的脊髓外傷、脊髓壓迫、胸腹主動(dòng)脈外科手術(shù)中動(dòng)脈的阻斷、損傷或低灌注壓造成的原發(fā)性損害。再灌注過(guò)程中可進(jìn)一步加重神經(jīng)元損害,引起再灌注損傷。再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的,涉及多種發(fā)病機(jī)制并影響缺血性疾病的預(yù)后,再灌注可以使可逆性缺血損傷加重,亦可能促進(jìn)可逆性缺血損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。探索脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制,并結(jié)合其發(fā)生機(jī)制制定切實(shí)有效的治療方案,做到既能保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流,又減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生,是脊髓缺血性損傷防治中亟待解決的重要課題。很多研究證實(shí)有多種因素參與和調(diào)節(jié)SCII,但它們的具體作用以及作用途徑目前尚未明了。良好的血液循環(huán)是組織細(xì)胞獲得充足的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并排除代謝產(chǎn)物的基本保證,各種原因造成的組織血液灌注減少可使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷,盡早恢復(fù)組織的血液灌注是減輕缺血性損傷的根本措施。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細(xì)胞移植是近年來(lái)興起的治療技術(shù),因此我們選擇轉(zhuǎn)基因技術(shù)與細(xì)胞移植技術(shù)結(jié)合的方法對(duì)脊髓缺血損傷進(jìn)行探索性的治療。進(jìn)行轉(zhuǎn)基因治療合適目的基因和載體的選擇非常重要。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是在1992年Semenza等[1]研究缺氧誘導(dǎo)的促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),它與增強(qiáng)脊髓組織細(xì)胞的耐受低氧能力,促進(jìn)脊髓新生血管的形成[2,3]密切相關(guān)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)在一定的條件下可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌母細(xì)胞[4]等,成為目前醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域最有潛力的研究工具。在體移植和離體實(shí)驗(yàn)均證實(shí),MSC可橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,對(duì)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的應(yīng)用前景[5]。因此我們利用缺氧誘導(dǎo)因子-1作為治療的目的基因并為其構(gòu)建合適的表達(dá)載體,選擇骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為靶細(xì)胞,并且在進(jìn)一步的研究中將構(gòu)建的HIF-1載體轉(zhuǎn)染到BMSC中。 實(shí)驗(yàn)一大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因表達(dá)載體的構(gòu)建 目的:構(gòu)建大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α的基因表達(dá)載體 方法:首先制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,分離脊髓組織并提取HIF-1α總mRNA,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成大鼠HIF-1α的cDNA;根據(jù)大鼠HIF-1α基因序列設(shè)計(jì)引物和酶切位點(diǎn),并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)進(jìn)行基因克隆,雙酶切驗(yàn)證后克隆入pcDNA3.1,雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。 結(jié)果:提取的mRNA完整,純度較高,OD=1.92;通過(guò)PCR擴(kuò)增出2472bp的基因片段,與大鼠HIF-1α基因長(zhǎng)度相符;雙酶切克隆載體可以得到2472bp目的片段,測(cè)序驗(yàn)證無(wú)堿基的改變。 結(jié)論:大鼠HIF-1α與pcDNA3.1連接正確;成功構(gòu)建了大鼠HIF-1α基因的表達(dá)載體。 實(shí)驗(yàn)二大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 目的:培養(yǎng)并獲得高純度的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。 方法:用淋巴細(xì)胞液分離法獲取大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞,于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng),融合達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),并傳至第三代;培養(yǎng)期間利用倒置顯微鏡觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性;利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD45和CD90的表達(dá)。 結(jié)果:倒置顯微鏡觀察到骨髓基質(zhì)細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),為類成纖維細(xì)胞樣,大而扁平,原代細(xì)胞形狀差別較大,第三代趨于穩(wěn)定,以梭形為主;免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定CD45呈陰性表達(dá)為3.63%,CD90表達(dá)較高為96.2%。 結(jié)論:大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好;獲得的第三代細(xì)胞純度較高。
[Abstract]:Spinal cord ischemic injury (Spinal Cord Ischemia Injury, SCII) is caused by a variety of reasons of spinal cord injury, spinal cord compression, artery occlusion surgery of thoracic and abdominal aortic surgery, injury or low perfusion pressure caused by the primary injury. Reperfusion may further aggravate neuronal damage caused by reperfusion injury. Reperfusion injury is and on the basis of ischemia injury, and the prognosis of many involved in the pathogenesis of ischemic disease, reperfusion can cause reversible ischemic injury, may promotereversible ischemic injury into irreversible injury. To explore the mechanism of spinal cord ischemia reperfusion injury, and the injury mechanism and treatment plan effectively, so as to ensure recovery of ischemic tissue blood flow as soon as possible, and reduce or prevent the occurrence of reperfusion injury, is to be solved in the prevention of ischemic spinal cord injury An important topic. Many studies have confirmed that there are many factors involved in the regulation and SCII, but their specific role and the pathway is not clear. Good blood circulation is the basic guarantee of tissue cells to obtain sufficient supply of oxygen and nutrients and remove metabolic products, all kinds of causes of perfusion reduction can make the cell ischemic injury. Early restoration of blood perfusion of the ischemic injury is to reduce the fundamental measures.
Transgenic technology and cell transplantation is the rise in recent years, treatment technology, so we choose the method combined with transgenic technology and cell transplantation technology to explore the treatment of spinal cord ischemia injury. Gene therapy suitable target gene and vector selection is very important. Hypoxia inducible factor -1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1) is a kind of the nuclear transcription factor found in the expression of erythropoietin induced by [1] Semenza in 1992 of the hypoxia gene, under hypoxic conditions exists widely in human and mammalian cells, and enhance spinal cord tissue hypoxia tolerance ability, promote spinal cord angiogenesis. [2,3] is closely related to bone marrow stromal cells (BMSC) can the induction and differentiation of neural cells, under certain conditions, myocardial cells, osteoblasts, adipocytes and muscle cells such as [4], the medicine and Biology Study on tool field in the future. In vivo transplantation and in vitro experiments confirmed that MSC can differentiate into nerve cells and glial cells, in the treatment of diseases of the central nervous system, the potential application prospect of [5]. so we use the hypoxia inducible factor -1 as target for radical treatment and also to construct a suitable expression vector. Selection of bone marrow stromal cells as target cells, cells transfected with HIF-1 and constructed in the study will further to BMSC.
Construction of an hypoxia inducible factor -1 - alpha gene expression vector in rats
Objective: to construct the gene expression vector of hypoxia inducible factor -1 alpha in rats
Methods: first, the preparation of rat spinal cord ischemia reperfusion injury model of spinal cord tissue separation and extraction of HIF-1 alpha mRNA, using reverse transcriptase polymerase chain reaction HIF-1 synthesis of rat alpha cDNA alpha gene in rat; according to the HIF-1 primers and restriction sites, and were amplified by PCR, the amplified products were purified connected to T vector and transformed into competent gene cloning, double enzyme digestion verification after cloned into pcDNA3.1, double enzyme digestion and sequencing results.
Results: the extracted mRNA was intact and highly purified, OD=1.92. The 2472bp gene fragment was amplified by PCR, which was consistent with the length of rat HIF-1 alpha gene. Double enzyme digestion cloned vector could get 2472bp target fragment, and sequencing verified no base change.
Conclusion: the connection between HIF-1 alpha and pcDNA3.1 is correct, and the expression vector of HIF-1 alpha gene in rats is successfully constructed.
The culture of bone marrow stromal cells in experimental two rats
Objective: to cultivate and obtain high purity bone marrow stromal cells.
Methods: the rat bone marrow stromal cells with lymphocyte separation, in culture flasks were cultured, passaged fusion reached 90%, and spread to the third generation; growth characteristics during the observation of bone marrow stromal cells by inverted microscope; used immunocytochemistry to detect expression of cell surface antigen CD45 and CD90.
Results: the inverted microscope showed that bone marrow stromal cells were adherent, fibroblast like, large and flat, primary cell shape differences, the third generation of stable spindle; immunocytochemistry was used to identify the expression of CD45 was negative for 3.63%, higher expression of CD90 for 96.2%.
Conclusion: the growth of rat bone marrow stromal cells in vitro is good, and the purity of the third generation cells obtained is high.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1412068