發(fā)布時間：2018-01-12 01:19

  本文關(guān)鍵詞：大鼠低氧誘導因子-1α基因載體的構(gòu)建及對骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)的實驗研究　出處：《第四軍醫(yī)大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 低氧誘導因子 脊髓缺血損傷 基因克隆 骨髓基質(zhì)細胞 細胞培養(yǎng)

【摘要】： 脊髓缺血損傷(Spinal Cord Ischemia Injury,SCII)是由各種原因引起的脊髓外傷、脊髓壓迫、胸腹主動脈外科手術(shù)中動脈的阻斷、損傷或低灌注壓造成的原發(fā)性損害。再灌注過程中可進一步加重神經(jīng)元損害,引起再灌注損傷。再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,涉及多種發(fā)病機制并影響缺血性疾病的預后,再灌注可以使可逆性缺血損傷加重,亦可能促進可逆性缺血損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。探索脊髓缺血再灌注損傷的機制,并結(jié)合其發(fā)生機制制定切實有效的治療方案,做到既能保證盡早恢復缺血組織的血流,又減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生,是脊髓缺血性損傷防治中亟待解決的重要課題。很多研究證實有多種因素參與和調(diào)節(jié)SCII,但它們的具體作用以及作用途徑目前尚未明了。良好的血液循環(huán)是組織細胞獲得充足的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并排除代謝產(chǎn)物的基本保證,各種原因造成的組織血液灌注減少可使細胞發(fā)生缺血性損傷,盡早恢復組織的血液灌注是減輕缺血性損傷的根本措施。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細胞移植是近年來興起的治療技術(shù),因此我們選擇轉(zhuǎn)基因技術(shù)與細胞移植技術(shù)結(jié)合的方法對脊髓缺血損傷進行探索性的治療。進行轉(zhuǎn)基因治療合適目的基因和載體的選擇非常重要。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是在1992年Semenza等[1]研究缺氧誘導的促紅細胞生成素基因表達時發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動物細胞內(nèi),它與增強脊髓組織細胞的耐受低氧能力,促進脊髓新生血管的形成[2,3]密切相關(guān)。骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)在一定的條件下可誘導分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞和肌母細胞[4]等,成為目前醫(yī)學及生物學領(lǐng)域最有潛力的研究工具。在體移植和離體實驗均證實,MSC可橫向分化為神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞,對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的應(yīng)用前景[5]。因此我們利用缺氧誘導因子-1作為治療的目的基因并為其構(gòu)建合適的表達載體,選擇骨髓基質(zhì)細胞作為靶細胞,并且在進一步的研究中將構(gòu)建的HIF-1載體轉(zhuǎn)染到BMSC中。 實驗一大鼠缺氧誘導因子-1α基因表達載體的構(gòu)建 目的:構(gòu)建大鼠低氧誘導因子-1α的基因表達載體 方法:首先制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,分離脊髓組織并提取HIF-1α總mRNA,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)合成大鼠HIF-1α的cDNA;根據(jù)大鼠HIF-1α基因序列設(shè)計引物和酶切位點,并進行PCR擴增,將擴增產(chǎn)物純化后連接T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)進行基因克隆,雙酶切驗證后克隆入pcDNA3.1,雙酶切及測序驗證結(jié)果。 結(jié)果:提取的mRNA完整,純度較高,OD=1.92;通過PCR擴增出2472bp的基因片段,與大鼠HIF-1α基因長度相符;雙酶切克隆載體可以得到2472bp目的片段,測序驗證無堿基的改變。 結(jié)論:大鼠HIF-1α與pcDNA3.1連接正確;成功構(gòu)建了大鼠HIF-1α基因的表達載體。 實驗二大鼠骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng) 目的:培養(yǎng)并獲得高純度的骨髓基質(zhì)細胞。 方法:用淋巴細胞液分離法獲取大鼠骨髓基質(zhì)細胞,于培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng),融合達90%時進行傳代培養(yǎng),并傳至第三代;培養(yǎng)期間利用倒置顯微鏡觀察骨髓基質(zhì)細胞的生長特性;利用免疫細胞化學法檢測細胞表面抗原CD45和CD90的表達。 結(jié)果:倒置顯微鏡觀察到骨髓基質(zhì)細胞呈貼壁生長,為類成纖維細胞樣,大而扁平,原代細胞形狀差別較大,第三代趨于穩(wěn)定,以梭形為主;免疫細胞化學法鑒定CD45呈陰性表達為3.63%,CD90表達較高為96.2%。 結(jié)論:大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)生長良好;獲得的第三代細胞純度較高。
[Abstract]:Spinal cord ischemic injury (Spinal Cord Ischemia Injury, SCII) is caused by a variety of reasons of spinal cord injury, spinal cord compression, artery occlusion surgery of thoracic and abdominal aortic surgery, injury or low perfusion pressure caused by the primary injury. Reperfusion may further aggravate neuronal damage caused by reperfusion injury. Reperfusion injury is and on the basis of ischemia injury, and the prognosis of many involved in the pathogenesis of ischemic disease, reperfusion can cause reversible ischemic injury, may promotereversible ischemic injury into irreversible injury. To explore the mechanism of spinal cord ischemia reperfusion injury, and the injury mechanism and treatment plan effectively, so as to ensure recovery of ischemic tissue blood flow as soon as possible, and reduce or prevent the occurrence of reperfusion injury, is to be solved in the prevention of ischemic spinal cord injury An important topic. Many studies have confirmed that there are many factors involved in the regulation and SCII, but their specific role and the pathway is not clear. Good blood circulation is the basic guarantee of tissue cells to obtain sufficient supply of oxygen and nutrients and remove metabolic products, all kinds of causes of perfusion reduction can make the cell ischemic injury. Early restoration of blood perfusion of the ischemic injury is to reduce the fundamental measures.
Transgenic technology and cell transplantation is the rise in recent years, treatment technology, so we choose the method combined with transgenic technology and cell transplantation technology to explore the treatment of spinal cord ischemia injury. Gene therapy suitable target gene and vector selection is very important. Hypoxia inducible factor -1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1) is a kind of the nuclear transcription factor found in the expression of erythropoietin induced by [1] Semenza in 1992 of the hypoxia gene, under hypoxic conditions exists widely in human and mammalian cells, and enhance spinal cord tissue hypoxia tolerance ability, promote spinal cord angiogenesis. [2,3] is closely related to bone marrow stromal cells (BMSC) can the induction and differentiation of neural cells, under certain conditions, myocardial cells, osteoblasts, adipocytes and muscle cells such as [4], the medicine and Biology Study on tool field in the future. In vivo transplantation and in vitro experiments confirmed that MSC can differentiate into nerve cells and glial cells, in the treatment of diseases of the central nervous system, the potential application prospect of [5]. so we use the hypoxia inducible factor -1 as target for radical treatment and also to construct a suitable expression vector. Selection of bone marrow stromal cells as target cells, cells transfected with HIF-1 and constructed in the study will further to BMSC.
Construction of an hypoxia inducible factor -1 - alpha gene expression vector in rats
Objective: to construct the gene expression vector of hypoxia inducible factor -1 alpha in rats
Methods: first, the preparation of rat spinal cord ischemia reperfusion injury model of spinal cord tissue separation and extraction of HIF-1 alpha mRNA, using reverse transcriptase polymerase chain reaction HIF-1 synthesis of rat alpha cDNA alpha gene in rat; according to the HIF-1 primers and restriction sites, and were amplified by PCR, the amplified products were purified connected to T vector and transformed into competent gene cloning, double enzyme digestion verification after cloned into pcDNA3.1, double enzyme digestion and sequencing results.
Results: the extracted mRNA was intact and highly purified, OD=1.92. The 2472bp gene fragment was amplified by PCR, which was consistent with the length of rat HIF-1 alpha gene. Double enzyme digestion cloned vector could get 2472bp target fragment, and sequencing verified no base change.
Conclusion: the connection between HIF-1 alpha and pcDNA3.1 is correct, and the expression vector of HIF-1 alpha gene in rats is successfully constructed.
The culture of bone marrow stromal cells in experimental two rats
Objective: to cultivate and obtain high purity bone marrow stromal cells.
Methods: the rat bone marrow stromal cells with lymphocyte separation, in culture flasks were cultured, passaged fusion reached 90%, and spread to the third generation; growth characteristics during the observation of bone marrow stromal cells by inverted microscope; used immunocytochemistry to detect expression of cell surface antigen CD45 and CD90.
Results: the inverted microscope showed that bone marrow stromal cells were adherent, fibroblast like, large and flat, primary cell shape differences, the third generation of stable spindle; immunocytochemistry was used to identify the expression of CD45 was negative for 3.63%, higher expression of CD90 for 96.2%.
Conclusion: the growth of rat bone marrow stromal cells in vitro is good, and the purity of the third generation cells obtained is high.

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 袁成良,金小嵐,侯建紅,栗群英,黃迎春;17β-雌二醇對骨髓基質(zhì)細胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ⅠA、ⅠB mRNA表達的影響[J];中國病理生理雜志;2004年02期

2 滕曉華;盧明;劉波;潘林香;周蓉;;不同年齡大鼠骨髓基質(zhì)細胞端粒酶活性及端粒長度的變化[J];中國組織工程研究與臨床康復;2007年42期

3 劉淑華,雷倫君,李志旺;小鼠骨髓基質(zhì)細胞的輻射敏感性及某些藥物對其作用的觀察[J];中國醫(yī)學科學院學報;1991年05期

4 趙杰,李紅燕,姚程,易永林,袁春英;自體骨髓基質(zhì)細胞體外擴增促進病人造血功能恢復的研究[J];武警醫(yī)學;1998年06期

5 侯麗君,張敬東,盧香蘭,李霞;急性髓性白血病骨髓基質(zhì)細胞白細胞介素-6分泌活性的研究[J];中國醫(yī)科大學學報;1999年04期

6 鄧力,李冰,彭雪梅;二甲胺四環(huán)素促進骨髓基質(zhì)細胞增殖作用的研究[J];華西藥學雜志;1999年04期

7 董啟榕,戴漣生,鄭祖根;骨髓基質(zhì)細胞體外增殖后移植修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究[J];中國矯形外科雜志;2000年10期

8 孫培鋒,張喜善,王信勝,辛紅梅;骨髓基質(zhì)細胞體外成骨的實驗研究[J];泰山醫(yī)學院學報;2001年04期

9 劉維鋼;骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)與成骨能力的研究概況[J];國外醫(yī)學.骨科學分冊;2001年02期

10 婁曉輝,張亞卓,孫梅珍,厲俊華;應(yīng)用人骨髓基質(zhì)細胞治療大鼠缺血性腦梗塞的實驗研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2002年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 沈健;俞康;;血寶和再障患者血清對骨髓基質(zhì)細胞的影響[A];中華醫(yī)學會第11屆全國內(nèi)科學術(shù)會議論文匯編[C];2007年

2 方希敏;李原;錢江潮;周海霞;王菊香;曾煒煒;徐霞;;正常骨髓基質(zhì)細胞對HL-60細胞分化作用的初探[A];第六屆江浙滬兒科學術(shù)會議暨兒科學基礎(chǔ)與臨床研究進展學術(shù)班論文匯編[C];2009年

3 豐盛梅;高建軍;顧淑珠;金慰芳;;增齡過程中大鼠骨髓基質(zhì)細胞PPARγ和Cbfα1表達的相關(guān)性研究[A];第七屆全國老年醫(yī)學學術(shù)會議暨海內(nèi)外華人老年醫(yī)學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 袁成良;;17β-雌二醇對骨髓基質(zhì)細胞PPAR-γ2 mRNA表達的影響[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學術(shù)會議暨骨質(zhì)疏松診斷技術(shù)繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

5 童秀珍;羅紹凱;李娟;鄒外一;彭愛華;張祥忠;洪文德;張國材;;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓基質(zhì)細胞IFN-γ、TNF-α mRNA的表達[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

6 楊志軍;羅永春;張洪鈿;戴宜武;徐如祥;;Sinerem標記大鼠骨髓基質(zhì)細胞及移植后活體示蹤研究[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

7 金小嵐;;雌二醇對骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化的影響[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學術(shù)會議暨骨質(zhì)疏松診斷技術(shù)繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

8 楊述華;劉日光;;脫蛋白骨復合轉(zhuǎn)染VEGF基因骨髓基質(zhì)細胞治療股骨頭缺血壞死的實驗研究[A];跨世紀骨傷杰出人才科技成果薈萃[C];2004年

9 曾東風;孔佩艷;陳幸華;常城;張曦;彭賢貴;高蕾;;阻抑HIF-1α基因表達對急性白血病骨髓基質(zhì)細胞SDF-1、VEGF表達的影響[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

10 朱波;鄒仲敏;羅成基;郭朝華;林遠;程天民;;放射損傷后骨髓基質(zhì)細胞IL-6表達的變化及其與NF-kB的關(guān)系[A];面向二十一世紀的生物醫(yī)學體視學和軍事病理學論文摘要匯編[C];2000年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 王雪飛 張秀花;修復軟骨 骨髓基質(zhì)細胞是最佳種子[N];健康報;2004年

2 ;單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂誘導成年大鼠骨髓基質(zhì)細胞成為神經(jīng)前體細胞及其分化作用的研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 匡遠深;治腦損傷可用骨髓細胞[N];健康報;2003年

4 馮友根;辛伐他汀促成骨作用研究[N];中國醫(yī)藥報;2004年

5 通訊員　匡遠深;骨髓基質(zhì)細胞移植治療腦梗塞取得突破[N];光明日報;2003年

6 朱國旺;防治骨質(zhì)疏松我們共同的責任[N];中國醫(yī)藥報;2002年

7 匡遠深;我國一項神外基礎(chǔ)實驗研究取得成果[N];中國醫(yī)藥報;2003年

8 汪敏 仇逸;低氧利于誘導白血病細胞分化[N];中國醫(yī)藥報;2003年

9 汪敏 仇逸;低氧能夠誘導白血病細胞分化[N];新華每日電訊;2003年

10 吳一福;心臟組織工程研究新進展[N];中國醫(yī)藥報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 王吉剛;TRAIL逆轉(zhuǎn)白血病骨髓基質(zhì)細胞粘附介導Jurkat細胞耐藥的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2005年

2 劉占川;rhG-CSF動員自體骨髓基質(zhì)細胞治療鼠局灶性腦缺血實驗研究[D];吉林大學;2006年

3 金鈁;組織工程骨修復牙槽骨缺損與正畸牙齒移動[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

4 崔玉明;組織工程化軟骨修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損及其相關(guān)研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

5 梁蓉;正常人骨髓成纖維樣基質(zhì)細胞系對急性髓細胞性白血病細胞增殖、分化和凋亡的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

6 朱國強;IGF-1基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細胞應(yīng)用于牙周組織工程的基礎(chǔ)與動物實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

7 宋艷秋;抗VEGF靶向治療白血病的研究[D];吉林大學;2006年

8 顧祖超;自體骨髓基質(zhì)細胞定向誘導成骨分化修復節(jié)段性骨缺損的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2002年

9 趙延欣;重組人粒細胞集落刺激因子對局灶性腦缺血保護作用機制的研究[D];復旦大學;2004年

10 鐘池;骨髓基質(zhì)細胞靜脈注射治療大鼠短暫性局灶性腦缺血的研究[D];復旦大學;2003年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 張振;大鼠低氧誘導因子-1α基因載體的構(gòu)建及對骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

2 張振;大鼠低氧誘導因子-1α基因載體的構(gòu)建及對骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

3 李軍;兔骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)及向成骨細胞分化的實驗研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2004年

4 仲維廣;兔骨髓基質(zhì)細胞誘導成骨及與珊瑚聯(lián)合培養(yǎng)實驗研究[D];昆明醫(yī)學院;2004年

5 郭偉翔;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向分化為心肌細胞的實驗研究[D];東北師范大學;2005年

6 高全文;VEGF基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細胞復合磷酸鈣陶瓷成骨能力研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

7 陳明;兔骨髓基質(zhì)細胞附著于自體牙骨質(zhì)片生長的體外研究[D];第一軍醫(yī)大學;2004年

8 周江;骨髓基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞聯(lián)合種植構(gòu)建組織工程化骨的研究[D];四川大學;2003年

9 谷云風;RCAS1在再生障礙性貧血中的表達[D];山西醫(yī)科大學;2010年

10 姜揚;靜脈注射骨髓基質(zhì)細胞治療大鼠局灶性腦缺血BDNF表達的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

，

本文編號：1412068