本文關(guān)鍵詞：PNRC在核仁的定位、功能及其剪接變異體的分析　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： PNRC 核仁 核仁定位序列 核磷蛋白 核仁素 rRNA 剪接變異體 輔活化子 核受體

【摘要】： 核受體(nuclear receptor, NR)是一類轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)機(jī)體的生殖、發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮極其重要的作用。核受體調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄通常需要募集輔調(diào)節(jié)子(coregulator)。在配體的作用下,核受體的構(gòu)象發(fā)生變化,變募集輔抑制子(corepressor)為募集輔活化子(coactivator),靶基因轉(zhuǎn)錄從抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ睢?富含脯氨酸核受體輔調(diào)節(jié)蛋白(proline-rich nuclear receptor coregulator protein, PNRC)是以類固醇衍生因子1(steroidogenic factor 1,SF1)為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)從人乳腺cDNA表達(dá)文庫篩選并鑒定的一核受體輔活化子(coactivator),除與SF1和孤兒受體ERRα及ERRγ相互作用外,PNRC還與ERα、ERβ、PR、GR、TR、RAR和RXR等核受體相互作用,增強(qiáng)其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活。此外,PNRC還能與Grb2相互作用,下調(diào)Ras和MAP激酶的激活。最近又發(fā)現(xiàn)PNRC通過與RNA多聚酶Ⅲ(RNA polⅢ)亞基RPC39結(jié)合刺激RNA polⅢ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 PNRC主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能,先前的研究也表明PNRC分子主要定位在細(xì)胞核內(nèi),但PNRC只有327氨基酸,分子量35.2 kD,理論上能自由進(jìn)出細(xì)胞核,因此我們推測PNRC分子上存在一定的核定位信號序列(nuclear localization signal, NLS)使其定位在細(xì)胞核內(nèi)而不擴(kuò)散到胞漿中。本研究在鑒定PNRC NLS的過程中,發(fā)現(xiàn)PNRC定位在核仁中并參與RNA多聚酶Ⅰ(RNA polⅠ)介導(dǎo)的核糖體RNA(rRNA)的合成。通過一系列的突變分析,我們鑒定位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)為PNRC的核仁定位序列(nucleolar targeting sequence,NTS)以及NLS。將此序列直接融合到綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)能將其帶到細(xì)胞核和核仁中。對PNRC NTS上的氨基酸殘基進(jìn)行逐點替代突變分析,發(fā)現(xiàn)位于氨基酸序列第100位的賴氨酸(lysine-100)是其NTS的關(guān)鍵殘基,但不是NLS的關(guān)鍵殘基,因為突變此氨基酸能顯著減少PNRC在核仁的定位,但不改變PNRC在細(xì)胞核中的定位。另外,我們證明像KKRRKK、KKKKKK和RRRRRR等連續(xù)的6個堿性氨基酸殘基就足于將GFP帶到核仁,因此它們可以做為潛在的NTS。通過免疫共沉淀實驗我們發(fā)現(xiàn)PNRC與核仁的主要蛋白—核磷蛋白(B23/nucleophosmin)相互作用,且PNRC作用位點為其NTS。我們還發(fā)現(xiàn):當(dāng)用低劑量放線菌素D(actinomycin D)抑制核糖體DNA(rDNA)的轉(zhuǎn)錄時,PNRC從核仁轉(zhuǎn)位到核漿中,而用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞則可增加PNRC在核仁的積累。此外,在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中,用小干擾RNA(siRNA)敲低PNRC的表達(dá)能顯著減少核糖體RNA(rRNA)的合成以及特異性地降低參與rRNA合成的核仁素(C23/nucleolin)的蛋白水平,而過表達(dá)PNRC則能升高核仁素的蛋白水平。總之,我們的結(jié)果表明PNRC是一核仁蛋白,位于94-101的氨基酸序列(94PKKRRKKK101)是其NTS,也是其NLS。PNRC可能通過這一序列與B23相互作用而定位到核仁中,并通過調(diào)節(jié)核仁素蛋白的水平參與rRNA的合成。 由于mRNA水平的選擇性剪接是調(diào)節(jié)蛋白功能的一個重要手段,本課題在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,通過克隆測序的策略鑒定了三個PNRC剪接變異體,分別命名為PNRC1c、PNRC1d和PNRC1f PNRC1c和PNRC1f是在PNRC基因外顯子1中選擇性剪切掉部分序列的產(chǎn)物,而PNRC1d則為PNRC基因選擇性使用另外一個啟動子的產(chǎn)物。PNRC1 c在選擇性剪接位點后面的序列未發(fā)生翻譯的讀碼移框,而只是框內(nèi)刪除79個氨基酸,而PNRC1f則在選擇性剪接位點其后的序列發(fā)生讀碼移框,并提前出現(xiàn)終止密碼子,PNRC1d編碼出的蛋白則為組成性剪接PNRC分子C末端的142個氨基酸。通過酵母雙雜交和報告基因分析等實驗,我們發(fā)現(xiàn)這些剪接變異體在與核受體的相互作用及輔激活核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的能力上存在極大的差異。另外,我們還發(fā)現(xiàn)剪接變異體PNRC1d具有調(diào)節(jié)組成性剪接體PNRC輔激活雌激素受體(ER)的功能�？傊�,此部分的研究表明PNRC存在功能不同的剪接變異體,選擇性剪接調(diào)節(jié)PNRC輔活化子的活性。
[Abstract]:Nuclear receptor ( NR ) is a kind of transcription factor , plays a very important role in regulating the reproduction , development and homeostasis of organism . The transcription of nuclear receptor regulates gene usually needs to raise coregulator . Under the action of ligand , the conformation of nuclear receptor changes , coregulator is coactivator , and the transcription of target gene is changed from inhibition to activation . In addition , PNRC interacts with the nuclear receptors such as ER偽 , ER尾 , PR , GR , TR , RARs and RXR to enhance the activation of Ras and MAP kinases . In addition , PNRC can interact with Grb2 to downregulate the activation of Ras and MAP kinases . In this study , we found that PNRC is a key residue in the nucleolus , but it is not a key residue of the PNRC . In addition , we have shown that PNRC is a key residue in the nucleolus , but it is not a key residue of the nuclear nucleolus . In addition , we prove that PNRC is a nuclear protein , and the amino acid sequence of PNRC is a nucleolar protein , and the amino acid sequence of PNRC is 94 - 101 ( 94PKKRRK101 ) . In this paper , we identified three PNRC splice variants , PNRC1c , PNRC1d and PNRC1f PNRC1c and PNRC1f , respectively , which were named PNRC 1c , PNRC1d and PNRC1f PNRC1c and PNRC1f .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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本文編號：1403030