本文關(guān)鍵詞：人體TRIP15蛋白的純化結(jié)晶及其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的研究　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 人TRIP15 表達(dá) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

【摘要】：人體甲狀腺激素受體相互作用蛋白15(thyroid hormone receptor interacting protein15, TRIP15)也被稱為CSN2、COPS2、SGN2、ALIEN,是核受體家族的選擇性轉(zhuǎn)錄共抑制子。TRIP15參與構(gòu)成COP9信號(hào)復(fù)合體,并與涉及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)的多種分子相互作用,影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,進(jìn)而與腫瘤、內(nèi)分泌疾病和脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)病相關(guān)。但迄今為止,仍未得到TRIP15的三維結(jié)構(gòu),也沒(méi)有其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells, HUV-EC-C)表達(dá)情況的報(bào)道。本論文將對(duì)TRIP15的克隆表達(dá)、純化結(jié)晶及其在HUV-EC-C的表達(dá)情況進(jìn)行研究。 本論文工作由兩部分組成。1.TRIP15蛋白質(zhì)的克隆表達(dá)、純化結(jié)晶：采用PCR從人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)獲得人TRIP15基因1332bp的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列。此片段經(jīng)BamH I及XhoI雙酶切后連接到同樣經(jīng)雙酶切處理的帶有GST標(biāo)簽的pGEX-6P-1載體上,轉(zhuǎn)染大腸桿菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),蛋白質(zhì)以部分可溶形式表達(dá),經(jīng)過(guò)親和層析、分子篩、超濾等手段得到適于結(jié)晶的電泳純蛋白質(zhì)。應(yīng)用氣相擴(kuò)散懸滴法篩選結(jié)晶條件并進(jìn)行結(jié)晶條件的優(yōu)化。將晶體進(jìn)行X射線晶體衍射實(shí)驗(yàn),但該晶體衍射能力很弱；2.通過(guò)RT-PCI及Western Blot技術(shù),證實(shí)TRIP15在HUV-EC-C中存在表達(dá),為后續(xù)TRIP15在HUV-EC-C中的功能研究(如RNAi及基因過(guò)表達(dá))奠定了基礎(chǔ)。 本論文的創(chuàng)新性體現(xiàn)在： 1.構(gòu)建了人體TRIP15在大腸桿菌中的表達(dá)載體,獲得了該蛋白質(zhì)表達(dá)純化及初步結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)條件； 2.在mRNA及蛋白質(zhì)水平證實(shí)了TRIP15在HUV-EC-C中存在表達(dá)。
[Abstract]:Thyroid hormone receptor interacting protein15. Trips 15) is also known as CSN2 / COPS2 / SGN2Alen. TRIP15, a selective transcriptional co-suppressor of nuclear receptor family, is involved in the formation of COP9 signal complex and interacts with many molecules involved in cell cycle regulation and repair of DNA damage. It affects cell proliferation, differentiation and apoptosis, which is related to tumor, endocrine disease and lipid metabolism disorder. However, up to now, the three-dimensional structure of TRIP15 has not been obtained. There was no umbilical vein endothelial cells in human umbilical vein endothelial cell line. In this paper, the cloning expression, purification and crystallization of TRIP15 and its expression in HUV-EC-C were studied. This thesis consists of two parts. 1. Cloning and expression of TRIP15 protein. Purified crystallization: the full-length encoding region of human TRIP15 gene 1332bp was obtained from human hepatocyte cDNA library by PCR. This fragment was amplified by BamH. I and XhoI were digested and ligated to pGEX-6P-1 vector with GST tag. After transfection with E. coli, the protein was expressed in partially soluble form after IPTG induction, and then the molecular sieve was obtained by affinity chromatography. The electrophoretic pure protein suitable for crystallization was obtained by ultrafiltration. The crystallization conditions were selected by gas phase diffusion suspension method and the crystallization conditions were optimized. The crystal was tested by X-ray crystal diffraction. But the diffraction ability of the crystal is very weak. 2.The expression of TRIP15 in HUV-EC-C was confirmed by RT-PCI and Western Blot. It lays a foundation for the functional study of TRIP15 in HUV-EC-C, such as RNAi and gene overexpression. The innovation of this thesis lies in: 1. The expression vector of human TRIP15 in Escherichia coli was constructed, and the experimental conditions for the expression, purification and primary crystallization of the protein were obtained. 2. The expression of TRIP15 in HUV-EC-C was confirmed at the level of mRNA and protein.
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411;R363

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