本文關(guān)鍵詞：攜帶中國(guó)CRF07_BC HIV-1毒株env基因的嵌合病毒SHIV構(gòu)建及體內(nèi)外生物學(xué)活性檢測(cè)　出處：《南開大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：艾滋病已成為影響人類健康最嚴(yán)重的傳染性疾病之一,各國(guó)迫切需要研制安全有效的艾滋病疫苗,然而至今還未有成功的范例。疫苗的安全性、有效性以及免疫策略需要在合適的動(dòng)物模型中進(jìn)行評(píng)價(jià),SHIV/恒河猴模型是應(yīng)用最為廣泛的動(dòng)物模型之一。SHIV,即SIV/HIV嵌合病毒,是利用基因重組技術(shù),將SIV和HIV的相應(yīng)基因進(jìn)行置換而構(gòu)建出來(lái)的重組嵌合病毒,然而尚未有代表中國(guó)HIV流行株高致病SHIV和動(dòng)物模型。 構(gòu)建中國(guó)HIV-1 CRF07 BC主要流行株基因CCR5嗜性的致病性SHIV/恒河猴艾滋病模型,對(duì)于設(shè)計(jì)艾滋病疫苗和免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)可以發(fā)揮重要作用。本研究以SHIV-89.6P的克隆株SHIV-KB9為主要骨架,將從AIDS患者臨床樣本中制備gp120和部分gp41(從N末端的50到780個(gè)氨基酸)的KpnI-BamHI基因片段替換SHIV-KB9的相應(yīng)區(qū)域,得到76個(gè)攜帶中國(guó)主要流行亞型CRF07 BC不同毒株env基因的SHIV cDNA嵌合克隆。將這些重組病毒cDNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒上清,分別感染TZM細(xì)胞系、人和猴的PBMC細(xì)胞,對(duì)所有克隆的生物學(xué)活性進(jìn)行細(xì)胞水平鑒定。通過SIV p27衣殼蛋白滴定,篩選到4株具有感染活性的SHIV cDNA克隆,分別為SHIV-XJN0363A4,SHIV-XJN036388,SHIV-XJN0421A17和SHIV-XJDC6431。通過對(duì)這4株SHIV病毒在恒河猴淋巴細(xì)胞中感染能力的比較,篩選活性最高的SHIV-XJDC6431進(jìn)行一系列細(xì)胞水平生物活性的比較。 透射電鏡觀察到SHIV-XJDC6431 cDNA克隆在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中包裝出病毒顆粒;利用表達(dá)不同輔助受體的細(xì)胞系確定SHIV-XJDC6431具有CCR5嗜性;SIVp27衣殼蛋白滴定描繪出其在人、恒河猴PBMC中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線,復(fù)制能力低于SHW-KB9,但高于本室構(gòu)建的SHIV-XJ01270和SHIV-CN97001;被感染過的恒河猴PBMC出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變;DNA PCR檢測(cè)到病毒已成功整合到人、恒河猴PBMC的基因組中;RT-PCR檢測(cè)到病毒在人、恒河猴PBMC培養(yǎng)上清中g(shù)ag-pol RNA轉(zhuǎn)錄本和(或)RNA基因組的形成。 隨后,將1000TCID_(50)的SHIV-XJDC6431病毒靜脈注射兩只中國(guó)恒河猴443號(hào)和444號(hào),兩只恒河猴感染特征基本一致。感染后20天左右出現(xiàn)病毒載量,峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚,僅達(dá)到10~(5.12)pg/ml和10~(5.47)pg/ml。檢測(cè)結(jié)果表明SHIV-XJDC6431可在第一代恒河猴443、444中有效復(fù)制,兩只動(dòng)物均表現(xiàn)出潛伏期穩(wěn)定的低水平病毒血癥過程。在444感染后第65天進(jìn)行了一次猴體傳代實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)過體內(nèi)適應(yīng)的病毒在第二代恒河猴體內(nèi)(445號(hào))表現(xiàn)出較高的感染活性和復(fù)制能力,感染445后第15天可檢測(cè)到病毒載量,且峰值出現(xiàn)在19天,可達(dá)到10_(6.98)pg/ml。通過病毒載量和外周血CD4~+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)第一代動(dòng)物表現(xiàn)出的感染活性較弱,與SHIV-KB9相比病毒載量峰值較低并且檢測(cè)到載量的時(shí)間點(diǎn)滯后。 總之,本研究成功構(gòu)建了四株在細(xì)胞水平具有感染活性的攜帶中國(guó)流行亞型HIV-1 env基因片斷的SHIV病毒株,其中一株SHIV-XJDC6431在動(dòng)物體內(nèi)已驗(yàn)證具有生物學(xué)活性。同時(shí),經(jīng)過猴體傳代試驗(yàn)?zāi)軌蛱岣咂涓腥尽?fù)制能力,并期望經(jīng)過后期多次動(dòng)物體內(nèi)傳代實(shí)驗(yàn),能夠篩選到高致病性的攜帶中國(guó)流行亞型env基因的SHIV病毒,為構(gòu)建評(píng)價(jià)AIDS/HIV疫苗的動(dòng)物模型提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:AIDS has become one of the most severe infectious diseases that affect human health, the urgent need for countries to develop a safe and effective vaccine against HIV, however there has not been successful so far. The vaccine's safety and effectiveness and immunization strategies need to be evaluated in an appropriate animal model, SHIV/ Ganges RIver monkey model is the most widely used animal model of.SHIV application of SIV/HIV chimeric virus, using gene recombination technology, recombinant chimeric virus corresponding gene SIV and HIV were constructed and replacement, but has not yet China representative HIV strains of highly pathogenic SHIV and animal model.
Construction of HIV-1 CRF07 BC China strains pathogenic SHIV/ gene CCR5 from Ganges RIver simian AIDS model, can play an important role in the evaluation of design AIDS vaccine and immune protection. In this study, the SHIV-89.6P clone of SHIV-KB9 as the main skeleton, from AIDS patients in clinical samples prepared by gp120 and gp41 (from 50 to the N terminal 780 amino acids) the corresponding region of the KpnI-BamHI gene fragment by SHIV instead of SHIV-KB9 and cDNA chimeric clone 76 carrying China major epidemic subtypes CRF07 BC strains env gene. The recombinant virus cDNA was transfected into 293T cells, the viral supernatant was collected, were infected TZM cells, human and monkey PBMC cells cell level, identification of the biological activity of all the clones. The SIV p27 capsid protein titration, screened 4 strains with SHIV cDNA clone infection activity, respectively, SHIV-XJN0363A4, SHIV-XJN036388, SHIV-XJN0421A17 and SHIV-XJDC6431. compared the biological activity of these 4 SHIV strains in Ganges RIver monkey lymphocytes by screening the SHIV-XJDC6431 with the highest activity.
Were observed by transmission electron microscopy SHIV-XJDC6431 cDNA clone packing of virus particles in 293T transfected cell lines; using the auxiliary receptor expression in different cell lines to determine SHIV-XJDC6431 with CCR5 tropism; SIVp27 capsid protein titration depict the people in Ganges RIver, replication kinetics curve of monkey PBMC in the replication capacity of less than SHW-KB9, but higher than the construction of SHIV-XJ01270 SHIV-CN97001; Ganges RIver monkey was infected PBMC cells appear obvious lesions; DNA PCR detected the virus has been successfully integrated into the genome of PBMC, Ganges RIver monkey; RT-PCR virus was detected in Ganges RIver, the monkey PBMC culture supernatant of gag-pol RNA transcripts and (or) the formation of RNA genome.
Subsequently, 1000TCID_ (50) SHIV-XJDC6431 intravenous injection of China virus two monkeys in Ganges RIver No. 443 and No. 444, two Ganges RIver monkey infected features are basically the same. 20 days after infection occurs around the viral load, the peak time of late, only reached 10~ (5.12) pg/ml and 10~ (5.47) PG /ml. detection results show that the SHIV-XJDC6431 can in the first generation of Ganges RIver in the 443444 monkey copy, two animal showed low levels of viremia during incubation period stable. A monkey body passage experiment was carried out in sixty-fifth days after infection 444, found that after in vivo adaptation of the virus in the second generation of Ganges RIver rhesus monkeys (445) showed higher activity of infection and replication capabilities 445, fifteenth days after infection can be detected viral load, and the peak appeared on the 19 day, can reach 10_ (6.98) pg/ml. by viral CD4~+T lymphocyte count in peripheral blood and analysis, found the first generation animal show sense The staining activity is weak, the peak value of the viral load is low compared with SHIV-KB9 and the time point of detecting the load is lagging.
In conclusion, this study successfully constructed four strains at the cellular level with infection activity to carry China subtypes HIV-1 env gene fragment of SHIV virus strains, one strain in SHIV-XJDC6431 animal model has been verified with biological activity. At the same time, after the monkey passage experiment can improve the ability of infection, replication, and expected after several animal in vivo passage experiment, screened to carry China subtypes of env gene of SHIV virus is highly pathogenic, and provide the material basis for establishing the animal model evaluation of AIDS/HIV vaccine.

【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.91;R392

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