本文關鍵詞：鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32的克隆、表達及其在鉤端螺旋體抗體檢測中的應用　出處：《福建醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的一種人獸共患的自然疫源性疾病。鉤體血清型別眾多,臨床表現多種多樣。目前鉤體病血清學的主要檢測方法是國家標準即顯微鏡凝集試驗(MAT),需要培養(yǎng)各種血清型的鉤體活菌,操作繁瑣,安全性差且需要暗視野顯微鏡,無法在基層開展該項目的檢測工作。鉤體外膜脂蛋白LipL32是各種致病性鉤體中高度保守的抗原成份,可刺激機體產生中和抗體。因此該抗原有可能應用于抗體檢測。 本課題用PCR法擴增致病性鉤端螺旋體黃疸出血群(56601株)LipL32蛋白的全長基因片段,與表達載體pET-3Oa(+)連接并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組蛋白,Western blot鑒定免疫活性后用電洗脫法進行純化。純化后的LipL32重組蛋白用間接ELISA和夾心ELISA法對不同的人和動物血清進行檢測,以MAT為參照標準進行比較。主要結果如下: 1.純化的重組蛋白用間接ELISA和夾心ELISA法對致病性鉤體15株標準菌株的兔免疫血清全部檢出,對7株腐生性鉤體菌株的兔免疫血清全部未檢出,與MAT檢測結果相符。表明該重組蛋白能區(qū)別腐生性和致病性鉤體感染。進一步確證黃疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因在致病性鉤體中高度保守。 2.重組蛋白檢測確診鉤體病人的9例急性期和恢復期雙份血清標本,急性期9份血清,MAT有2份出現陽性,間接ELISA和夾心ELISA法分別可檢出3份和2份陽性,進口ELISA檢測試劑盒則是2份陽性,4份可疑。對于恢復期9份血清,MAT檢出9份陽性,間接ELISA和夾心ELISA法均檢出8份陽性,進口ELISA則是1份陽性,7份可疑。提示該重組蛋白包被的間接ELISA和夾心ELISA在鉤體病檢測方面與MAT相似,恢復期優(yōu)于進口試劑盒。 3.重組蛋白檢測不同血清標本,45份MAT陽性標本,間接ELISA法敏感性為71.11%(32/45),夾心ELISA敏感性為80.00%(36/45),而進口ELISA試劑盒檢測則是陽性13份,占28.89%(13/45),25份可疑占55.56%(25/45)。在特異性檢測方面,檢測MAT陰性血清59份(其中健康體檢血清43份,非鉤體發(fā)熱病人16份,包括恙蟲病陽性和出血熱陽性各8份)間接ELISA和夾心ELISA法特異度均為96.61%(57/59),進口ELISA檢測健康體檢血清14份,均為陰性,檢測非鉤體發(fā)熱病人16份,則出現1份陽性,12份可疑。對梅毒螺旋體質控陽性血清10份,四種方法均為陰性。證明該重組抗原在敏感性方面略高于進口試劑盒,特異性與MAT相同,大大好于進口試劑盒,在鉤體流行病學大樣本人群調查中可用于初篩。 4.重組蛋白應用于夾心ELISA法檢測鼠血清標本,以MAT為標準。檢測274份標本,夾心ELISA的敏感性為86.75%(131/151),特異性為99.19%(122/123),符合率為92.34%(253/274)。結果表明夾心ELISA對鼠血清鉤體抗體的檢測顯示較好的敏感性和特異性。夾心ELISA操作簡單,特別適用于大樣本鉤體病現場血清流行病學宿主動物的調查。
[Abstract]:Leptospirosis (Leptospirosis) is a natural zoonotic disease caused by pathogenic leptospirosis (Leptospira). There are many serotypes of leptospirosis. There are many clinical manifestations. At present, the main detection method of leptospirosis serology is the national standard, I. E. microscope agglutination test, which requires the cultivation of various serotypes of live Leptospira bacteria, and the operation is cumbersome. The safety of Leptospira outer membrane lipoprotein LipL32 is a highly conserved antigen component of various pathogenic leptospirosis due to its poor security and the need for dark field microscope. The detection of Leptospira outer membrane lipoprotein (LipL32) can not be carried out at the grass-roots level. Can stimulate the body to produce neutralizing antibodies. Therefore, the antigen may be used in antibody detection. In this study, the full-length gene fragment of LipL32 protein of pathogenic leptospira jaundice haemorrhage strain 56601 was amplified by PCR. The recombinant protein was ligated with pET-3Oa() and expressed in E. coli BL21DE3. Western. The purified LipL32 recombinant protein was detected by indirect ELISA and sandwich ELISA methods. The main results are as follows: 1. The purified recombinant protein was detected by indirect ELISA and sandwich ELISA for rabbit immune serum of 15 standard strains of pathogenic leptospira. The rabbit immune serum of 7 strains of Leptospira rot was not detected. The results of MAT showed that the recombinant protein could distinguish between rancid and pathogenic leptospirosis, and further confirmed that 56601 strains of jaundice haemorrhage. The outer membrane lipoprotein (LipL32) gene is highly conserved in pathogenic leptospirosis. 2. Two serum samples of 9 patients with Leptospira confirmed by recombinant protein were detected in acute phase and convalescence stage, and 2 of 9 serum samples were positive in acute phase. Indirect ELISA and sandwich ELISA methods could detect 3 and 2 positive samples respectively, while imported ELISA kits were 2 positive and 4 suspicious. 9 sera were found in convalescent stage. 9 cases were positive in MAT, 8 cases were positive in indirect ELISA and sandwich ELISA method, and 1 case was positive in imported ELISA. It was suggested that the indirect ELISA and sandwich ELISA coated with the recombinant protein were similar to those of MAT in the detection of leptospirosis, and the recovery period was better than that of the imported kit. 3.The sensitivity of indirect ELISA assay for detecting 45 MAT positive samples from different serum samples was 71.11 and 32 / 45). The sensitivity of sandwich ELISA was 80.000.36 / 45, while the imported ELISA kit was positive in 13 samples, accounting for 28.8913 / 45). In terms of specificity, 59 MAT negative sera were detected (43 in health examination and 16 in patients with non-leptospirosis). The heterogeneity of indirect ELISA and sandwich ELISA were 96.61% and 57 / 59, including 8 cases of tsutsugamushi disease positive and 8 cases of haemorrhagic fever respectively. 14 healthy serum samples were detected by imported ELISA, all of them were negative, 16 cases of non-leptospirosis fever patients were detected, 12 cases were suspicious and 10 cases were positive for Treponema pallidum (Treponema pallidum) quality control. All the four methods were negative. It was proved that the recombinant antigen was slightly more sensitive than the imported kit, and the specificity was the same as that of MAT, which was much better than that of the imported kit. It can be used for primary screening in large sample population survey of leptospirosis. 4. The recombinant protein was used to detect mouse serum samples by sandwich ELISA, and 274 samples were detected by MAT. The sensitivity of sandwich ELISA was 86.75 / 151, and the specificity was 99.19 / 122 / 123). The coincidence rate was 92.34 / 253 / 2740.The results showed that sandwich ELISA showed better sensitivity and specificity for detection of rat serum leptospira antibody. Sandwich ELISA was simple to operate. It is especially suitable for seroepidemiological host animals in large sample of leptospirosis.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R446.6

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