本文關(guān)鍵詞：表皮葡萄球菌肽脫甲�；富蚬δ艿难芯�　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是一種寄居在人體表面的正常菌群,通常情況下不會(huì)引起致病,是一種機(jī)會(huì)致病菌,近年來在臨床上由于各種人工醫(yī)療材料的使用(如靜脈插管,導(dǎo)尿管等),表皮葡萄球菌致病的報(bào)道日益增多,表皮葡萄球菌的感染日益加劇,目前已經(jīng)成為院內(nèi)感染的前四大病原體之一。加上近年來抗菌藥物的濫用,導(dǎo)致臨床上耐藥菌株,多重耐藥菌株層出不窮,研究新型抗表皮葡萄球菌的藥物迫在眉睫。肽脫甲�；�(peptide deformylase, PDF)是目前發(fā)現(xiàn)的抗菌藥物靶點(diǎn)之一。在表皮葡萄球菌ATCC 35984和12228基因組比較分析的基礎(chǔ)之上,發(fā)現(xiàn)兩株菌均含有兩個(gè)編碼肽脫甲�；傅幕�,def和def2,分別編碼SePDF1和SePDF2蛋白,我們對其進(jìn)行了研究。 肽脫甲酰基酶廣泛存在于真細(xì)菌中,是蛋白質(zhì)合成過程中不可或缺的關(guān)鍵酶。原核生物蛋白質(zhì)的合成起始于甲�；募琢虬彼醫(yī)RNA(f-Met-tRNA),當(dāng)N端的肽鏈從核糖體中釋放的時(shí)候,肽脫甲�；盖谐柞；�,繼而MAP (methionine aminopeptidase)切除N端的甲硫氨酸,肽鏈方可正確的折疊。在真核生物蛋白合成過程中,不需要肽脫甲�；傅墓δ�,因此細(xì)菌的肽脫甲�；缚梢宰骺咕幬锏陌悬c(diǎn)。 為了研究以表皮葡萄球菌肽脫甲酰基酶為靶標(biāo)的可能性,本文利用基因克隆技術(shù),從表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株中克隆了兩個(gè)具有肽脫甲�；窹DF特征的基因def和def2,編碼產(chǎn)物分別為TypeⅡ型的SePDF1和TypeⅠ型的SePDF2,體外重組表達(dá)了SePDF1和SePDF2蛋白。通過甲酸脫氫酶偶聯(lián)的方法建立了肽脫甲�；该富顧z測的方法,結(jié)果顯示SePDF1為具有活性的表皮葡萄球菌的肽脫甲�；�,我們對其結(jié)合不同離子的蛋白活性進(jìn)行了比較,而SePDF2不具有肽脫甲�；富钚�,我們構(gòu)建了其酶活部位突變體對其進(jìn)行了初步分析。 第一章表皮葡萄球菌肽脫甲�；�1的功能研究 為了研究表皮葡萄球菌肽脫甲�；�1的功能,以表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株的基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增出def基因,長度為522bp。將其連接到克隆表達(dá)載體pET-22b中,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),通過IPTG的誘導(dǎo),可以獲得含6×His的體外表達(dá)重組SePDF1蛋白。利用6×His與Ni-NTA的高親和力,純化得到SePDF1蛋白。由于Fe2+離子體外的不穩(wěn)定性,所以實(shí)驗(yàn)采用Co2+,Ni2+, Zn2+三種二價(jià)離子來代替Fe2+離子,對SePDF1蛋白進(jìn)行體外的研究。首先利用向LB培養(yǎng)基中加入Co2+, Ni2+, Zn2+三種離子的方法來獲得含單一離子的SePDF1蛋白,但隨后的原子吸收光譜實(shí)驗(yàn)表明,由于LB培養(yǎng)基中各類離子成分復(fù)雜,用這種方法獲得的SePDF1蛋白中各種離子的含量較雜,純化得到的蛋白并非只含單一離子。因此改用成分可控的限制性培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,向限制性培養(yǎng)基中加入Co2+, Ni2+, Zn2+三種離子培養(yǎng)細(xì)菌可以獲得高純度的只含有單一Co2+或Zn2+離子的SePDF1,而加入Ni2+離子的培養(yǎng)基純化得到的SePDF1中并不能測到的Ni2+存在,推測原因是由于Ni2+對SePDF1的親和力較低引起。利用FDH(甲酸脫氫酶)偶聯(lián)的方法,采用N端甲�；娜膄-MAS作為底物,對獲得的三種SePDF1進(jìn)行酶活檢測發(fā)現(xiàn)含Co2+離子的SePDF1蛋白活性最高,而Ni2+, Zn2+-SePDF活性較低。而與SePDF1高度同源的金黃色葡萄球菌肽脫甲�；�(SaPDFB)的Ni2+形式活性最強(qiáng),說明金屬離子對PDF酶催化活性的關(guān)鍵作用,通過對SePDF金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變(C111S)也驗(yàn)證了這一說法,突變后的SePDF1由于金屬離子結(jié)合能力的喪失,失去了活性。對活性最高的Co-SePDF1進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定,采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法計(jì)算得到其Km值為2.227 mM, kcat/Km為6.3×104M-1*sec-1。而快速蛋白液相色譜(FPLC)實(shí)驗(yàn)表明,SePDF1在溶液狀態(tài)中以單體狀態(tài)存在。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已有的SePDF1蛋白晶體結(jié)構(gòu),采用計(jì)算機(jī)高通量虛擬篩選小分子先導(dǎo)化合物庫,得到了88個(gè)具有潛在抑制SePDF1酶活性的小分子先導(dǎo)化合物,采用128μg/ml的濃度對88個(gè)小分子化合物的抑菌濃度進(jìn)行初篩,其中6個(gè)對表皮葡萄球菌具有抑制效果,進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)化合物均對表皮葡萄球菌35984有較強(qiáng)的殺菌效果,然而在酶活抑制實(shí)驗(yàn)中,則發(fā)現(xiàn)這6個(gè)小分子化合物均無抑制SePDF1的活性,且對真核細(xì)胞具有毒性,說明此小分子化合物不能作為抗菌藥物研發(fā)的先導(dǎo)化合物。 第二章表皮葡萄球菌肽脫甲�；�2基因功能的初步研究 肽脫甲�；感惺构δ艿那疤崾荕et-tRNA在甲�；D(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲�；�,而表皮葡萄球菌的甲�；D(zhuǎn)移酶編碼基因fmt與def2基因在基因組上緊密相鄰,并且革蘭氏陰性菌株的肽脫甲�；富蚍植家彩峭鋐mt基因緊密相鄰。生物信息學(xué)分析顯示def2編碼的SePDF2屬于TypeⅠPDF,并且RT-PCR檢測結(jié)果顯示def2基因在表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株生長過程中可持續(xù)表達(dá)。為了研究SePDF2功能,本實(shí)驗(yàn)將def2基因的PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pET-24+,表達(dá)的融合蛋白SePDF2-His通過Ni-NTA親和層析純化獲得高純度的重組蛋白。然而,利用SePDF1酶活測定法檢測,結(jié)果顯示SePDF2不具有肽脫甲�；傅幕钚�。通過氨基酸序列的比對,發(fā)現(xiàn)SePDF2蛋白在PDF活性中心的三段高度保守的序列上均有氨基酸的差異,將此序列上氨基酸差異位點(diǎn)按照具有活性的枯草桿菌PDF序列進(jìn)行改變(A44G, A45V, A46G, I47L, S48A, S90C, I91L, L131Q, M133E),盡管改變后的SePDF2在催化中心的三段基序上與枯草桿菌BsPDF1 (陽性菌TypeⅠ)完全一致,仍未能使SePDF2獲得肽脫甲�；富钚浴ef2基因在細(xì)菌生長過程中持續(xù)轉(zhuǎn)錄卻不表達(dá),其在細(xì)菌中的功能有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Staphylococcus aureus is a kind of normal flora on the surface of human body . It is an opportunistic pathogen . In recent years , it has become one of the first four pathogens of nosocomial infection . In recent years , it has become one of the first four pathogens of nosocomial infection . In the process of synthesizing eukaryotic protein , the peptide deacylase can be used as the target of antibacterial drug . In order to study the possibility of targeting Staphylococcus aureus peptide , we cloned two genes def and def2 , which have the PDF characteristics of peptides from S . S . S . S . ATCC 35984 , and the SePDF1 and SePDF2 proteins were cloned and expressed in vitro . The results showed that SePDF1 was a kind of peptide deacylase with activity . The results showed that SePDF1 was a peptide deacylase with activity . The results showed that SePDF1 was the activity of peptide deacylase , and SePDF2 did not have peptide deacylase activity . Study on the Function of First - chapter Staphylococcus Epideric Peptide Deformacyl - 1 In order to study the function of S . S . S . S . S . S . S . aureus ATCC 35984 strain , we have obtained SePDF1 protein with a length of 522bp by using three kinds of ion such as Co 2 + , Ni 2 + , Zn2 + . Among them , 6 of them have inhibitory effect on staphylococcus aureus 35984 , but in enzyme activity inhibition experiment , it is found that these six small molecule compounds do not inhibit the activity of SePDF1 , and have toxicity to eukaryotic cells , suggesting that the small molecule compound can not be used as a leading compound for research and development of antibacterial drugs . Chapter II Preliminary Study on the Gene Function of Staphylococcus Epideric Peptide Deformacyl - 2 Gene In order to study the function of SePDF2 , SePDF2 encoded by def2 was inserted into the prokaryotic expression vector pET - 24 + .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R378

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本文編號：1383113