本文關(guān)鍵詞：抗沙門氏菌IgY抗體的制備及其特性分析　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的 沙門氏菌是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道中的革蘭氏陰性菌,屬于腸道菌群,是引起人類腹瀉的主要病原體。卵黃免疫球蛋白IgY (Immunoglobulin yolk),也稱為卵黃抗體。在結(jié)構(gòu)和免疫特性上不同于哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白IgG,與IgG相比具有物理化學(xué)穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)。因此,IgY作為替代傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物抗體的潛力受到廣泛的關(guān)注。本文用減毒沙門氏菌作為抗原免疫母雞制備成抗沙門氏菌的IgY (AS-IgY),并對(duì)其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性進(jìn)行分析,這為沙門氏菌的治療和預(yù)防性抗體的研制奠定基礎(chǔ)。 方法 1.免疫原為減毒沙門氏菌菌株Ty21a型,為沙門氏菌K抗原類。 2.6月齡雌性健康產(chǎn)蛋京白雞,體重1300±100g,每周產(chǎn)蛋5-6枚,正常飼養(yǎng)1周后免疫。 3.用減毒沙門氏菌菌株Ty21a作為抗原,按照109個(gè)細(xì)胞/只雞免疫進(jìn)行接種;初次免疫時(shí)加入等量的福氏完全佐劑,分別于雙翅膀皮下、左右背部皮下進(jìn)行點(diǎn)注射。以后每2周免疫1次,共3次,但不加佐劑,劑量、部位同初次免疫。末次免疫后,每2個(gè)月強(qiáng)化免疫1次,使抗體維持在一個(gè)較高的水平。免疫1周后,收集雞蛋并做好標(biāo)記,4℃保存?zhèn)溆谩?4.收集免疫前及免疫后第15、20、25、30、35、40、45天的雞蛋為研究對(duì)象。AS-IgY抗體的純化采用去除蛋清,收集卵黃液經(jīng)過蒸餾水粗提,50%飽和硫酸銨鹽析,透析、以及聚乙二醇濃縮等步驟得到純化的IgY抗體。 5.通過蛋白質(zhì)定量后,再經(jīng)過SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法對(duì)所純化抗體的特性進(jìn)行鑒定。 6.通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)活性。 結(jié)果 免疫后10天左右,即可從卵黃中檢測(cè)出特異性IgY抗體,30天左右抗體量達(dá)到高峰,每個(gè)卵黃可提取100～200mg抗體。該抗體具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和耐酸性,效價(jià)可持續(xù)2～6個(gè)月。還原性SDS-PAGE顯示該抗體呈現(xiàn)兩條帶,分子量約20KD和70KD。ELISA結(jié)果顯示,IgY與鏈球菌、白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等其他抗原之間無交叉反應(yīng),并可在體外抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。 結(jié)論 1.已成功制備出高純度的抗沙門氏菌IgY抗體(AS-IgY)。 2.通過SDS-PAGE、Western blot以及ELISA等對(duì)其理化性質(zhì)的分析結(jié)果表明,此抗體是一種耐酸、耐熱、產(chǎn)量高并且制備簡(jiǎn)便的新型抗體。 3.AS-IgY抗體在體外能夠抑制沙門氏菌的生長(zhǎng),與無關(guān)抗原無交叉反應(yīng)。 4.AS-IgY抗體有可能為沙門氏菌感染的治療和預(yù)防提供新的研究手段。
[Abstract]:objective
Salmonella is a group of gram negative bacteria that colonize the intestine of human and animal, belonging to gut bacteria is the major pathogen causing human diarrhea. Yolk immunoglobulin IgY (Immunoglobulin yolk), also known as egg yolk antibody. The structures and immunological characteristics different from mammalian immunoglobulin IgG, compared with IgG it has several advantages of physical and chemical stability. Therefore, IgY as an alternative to traditional mammalian antibody potential has been widely concerned. In this paper, using attenuated Salmonella as immune antigen hen prepared against Salmonella IgY (AS-IgY), and the physicochemical properties and biological activity were analyzed, which laid the foundation for treatment and the prevention of Salmonella antibody development.
Method
1. immunogen was attenuated Salmonella strain Ty21 a, K for Salmonella antigens.
2.6 month old female healthy laying Jingbai chicken, weight 1300 + 100g, weekly egg 5-6, normal feeding 1 weeks after immunization.
3. with the attenuated Salmonella typhimurium strain Ty21a as antigen in 109 cells / chicken immune vaccination; the first immunization when adding the same amount of complete Freund's adjuvant, respectively in the wings subcutaneous, subcutaneous injection of about 2 weeks after each immunization for 1 times, a total of 3 times, but not kasano agent. Parts of the same dose, the first immunization. After the last immunization, immunization for 1 times every 2 months, the antibody is maintained at a high level. 1 weeks after immunization, egg collection and mark, 4 degrees preservation reserve.
4., we collected the eggs before and after 15,20,25,30,35,40,45 days of immunization. The purification of.AS-IgY antibodies was achieved by removing egg white, collecting yolk solution, distilling water, crude 50%, ammonium sulfate salting out, dialysis and polyethylene glycol concentration, and then purified IgY antibody.
5. after quantitation of protein, the characteristics of the purified antibody were identified by SDS-PAGE, Western blot and ELISA.
6. the biological activity was verified by the bacteriostasis experiment in vitro.
Result
About 10 days after immunization, which can detect the specific IgY antibody from egg yolk, 30 days the amount of antibody reached the peak, each egg yolk.contains 100 ~ 200mg antibody. It has high thermal stability and acid resistance of the antibody titer continued for 2 to 6 months. Reduction of SDS-PAGE showed that the antibody showed two bands the molecular weight of about 20KD, and the results of 70KD.ELISA showed that IgY and Candida albicans, Streptococcus, Escherichia coli, no cross reaction between Staphylococcus aureus and other antigens, and can inhibit the growth of Salmonella in vitro.
conclusion
1. the high purity of Salmonella resistant IgY antibody (AS-IgY) has been successfully prepared.
2. through SDS-PAGE, Western blot and ELISA analysis of its physical and chemical properties, it is shown that the antibody is an acid, heat resistant, high yield and simple preparation of new antibodies.
3.AS-IgY antibodies can inhibit the growth of Salmonella in vitro, and have no cross reaction with unrelated antigens.
4.AS-IgY antibodies may provide new research methods for the treatment and prevention of Salmonella infection.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1381742