本文關(guān)鍵詞：體外持續(xù)傳代對(duì)人胎兒來(lái)源干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：研究體外持續(xù)傳代對(duì)兩種人胎兒來(lái)源干細(xì)胞（臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞）基本特性、致瘤性及干性等生物學(xué)特性的影響，為干細(xì)胞的質(zhì)量監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：使用相同方法分離獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（n=3）和羊膜上皮細(xì)胞（n=8）進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)，研究第7、14和21代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本特性（形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期、凋亡和衰老）、致瘤性（染色體數(shù)量和致瘤基因表達(dá)）以及干性（表型、干性基因表達(dá)、心肌、神經(jīng)和肝分化能力）的差別，并探討原代羊膜上皮細(xì)胞干性標(biāo)志物SSEA-4的表達(dá)水平與體外培養(yǎng)后細(xì)胞表型以及分化能力變化的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果： 1.持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 1）持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本特性的作用規(guī)律 初代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，隨著傳代次數(shù)的增加，部分細(xì)胞變得寬大，細(xì)胞增殖速率下降，出現(xiàn)了S和G2期阻滯現(xiàn)象，但三個(gè)代數(shù)細(xì)胞間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，三個(gè)代數(shù)細(xì)胞均未發(fā)生明顯凋亡：活細(xì)胞（Annexin V-/PI-細(xì)胞）比例均超過(guò)90%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，與第7代及第14代相比，第21代衰老細(xì)胞比例顯著增高（P7：0.032±0.018；P14:0.062±0.038；P21:0.229±0.019）。衰老相關(guān)的P21基因表達(dá)也顯著升高（P21：0.050±0.020，P14：0.007±0.001，P7：0.010±0.004）（P0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第14代以內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠較好地保持其基本特性，而第21代細(xì)胞則出現(xiàn)了明顯衰老。 2）持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤性的作用規(guī)律 三個(gè)代數(shù)細(xì)胞染色體數(shù)量未發(fā)生變化，癌基因E-Ras的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，第21代癌基因c-Myc（0.047±0.005）的表達(dá)則顯著高于第7（0.014±0.006）和14代（0.011±0.002）（P0.05）。這些結(jié)果表明，盡管第21代細(xì)胞染色體數(shù)量正常，但癌基因的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示高代數(shù)細(xì)胞可能具有較高的致瘤性。 由于第21代細(xì)胞衰老和癌基因表達(dá)均顯著升高，因此在之后的干性研究中只選擇使用第7和第14細(xì)胞。 3）持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞干性的作用規(guī)律 三個(gè)代數(shù)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞典型的表面標(biāo)志物（CD73、CD90和CD105）表達(dá)均高于99%，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物HLA-DR和CD45，各代數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與第7代細(xì)胞相比，，第14代細(xì)胞的干性基因Oct3/4（P7：2.378E-5±1.347E-5，P14：1.955E-5±3.692E-6）、Nanog（P7：1.063E-5±5.722E-6，P14：6.517E-6±2.666E-6）、Vimentin （P7：0.507±0.144，P14：0.323±0.041），外胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物Nestin（P7：9.421E-4±2.011E-4，P14：6.952E-4±2.906E-4）和中胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物GATA4（P7：3.215E-5±3.716E-5，P14：5.082E-6±5.293E-6）的表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，內(nèi)胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物AFP（P7：5.891E-5±2.439E-5，P14：9.916E-5±2.620E-5）有上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，心肌誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第7代細(xì)胞的心肌標(biāo)志物α-actinin的蛋白表達(dá)（0.111±0.030）顯著高于第14代（0.033±0.006）細(xì)胞（P0.05），這說(shuō)明第7代細(xì)胞具有較高的心肌分化能力。神經(jīng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示：第14代細(xì)胞中Nestin（27.2±12.0%）、β-tubulin Ⅲ（70.4±4.5%）陽(yáng)性細(xì)胞的比例較之第7代（Nestin：20.9±0.8%；β-tubulinⅢ：38.6±10.2%）細(xì)胞表達(dá)升高， β-tubulin Ⅲ有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）， Nestin無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），這說(shuō)明第14代細(xì)胞具有較高的神經(jīng)分化能力。此外，早期肝誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7代細(xì)胞的肝功能標(biāo)志物Albumin的基因（P7：16.433±12.921，P14：12.967±1.358）（P0.05）及蛋白表達(dá)（P7：0.382±0.270，P14：0.260±0.127）有高于P14代的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示第7代細(xì)胞可能具有較高的肝分化潛能，但受到個(gè)體差異的影響。 2.持續(xù)傳代對(duì)羊膜上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 流式細(xì)胞儀分析表明，不同樣本來(lái)源的原代羊膜上皮細(xì)胞干性標(biāo)志物SSEA-4的表達(dá)在26.7%-97%之間，存在很大的個(gè)體差異。第2代細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，SSEA-4表達(dá)水平明顯降低，其下降程度與原代細(xì)胞SSEA-4的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。另外，傳代培養(yǎng)后羊膜上皮細(xì)胞的心肌分化潛能也存在很大個(gè)體差異，且其差異與原代細(xì)胞SSEA-4表達(dá)水平的高低無(wú)關(guān)。 結(jié)論： 1.第14代之內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞較好地保持了其基本特性，未發(fā)生明顯衰老，且具有較低的癌基因表達(dá)，因此更適合再生醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用。 2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明，盡管受到個(gè)體差異的影響，但是體外持續(xù)傳代對(duì)不同分化方向有不同的作用規(guī)律，較低代數(shù)細(xì)胞的心肌及肝分化能力可能較高，而較高代數(shù)細(xì)胞的神經(jīng)分化能力可能較強(qiáng)，因此在具體應(yīng)用中需要考慮體外傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具體分化方向及能力的影響，盡可能選擇適合代數(shù)的細(xì)胞，同時(shí)加強(qiáng)干細(xì)胞的質(zhì)量監(jiān)控，以提高安全性和有效性。 3.不同樣本來(lái)源的原代羊膜上皮細(xì)胞的SSEA-4表達(dá)水平受到個(gè)體差異的影響，需要建立更準(zhǔn)確的臨床樣本篩選指標(biāo)來(lái)穩(wěn)定獲得原代高表達(dá)SSEA-4的胎兒樣本，以實(shí)現(xiàn)對(duì)羊膜上皮細(xì)胞的質(zhì)量監(jiān)控。另外，體外培養(yǎng)過(guò)程中SSEA-4的表達(dá)水平受到培養(yǎng)條件的影響，需要繼續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)條件以維持其高表達(dá)。此外，羊膜上皮細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的能力受到樣本個(gè)體差異以及培養(yǎng)條件的影響，在今后還需要進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Objective: To study the effects of continuous passage on biological characteristics of two human fetal stem cells (umbilical cord mesenchymal stem cells and amniotic epithelial cells), including tumorigenicity and dry matter, and provide experimental basis for quality monitoring of stem cells.
Methods: using the same method of isolated primary human umbilical cord mesenchymal stem cells (n=3) and human amniotic epithelial cells (n=8) were continuously subcultured on the 7,14 and the 21 generation of human umbilical cord mesenchymal stem cells basic characteristics (morphology, proliferation, cell cycle, apoptosis and senescence), tumorigenicity (chromosome number and tumorigenic gene expression) and dry (dry phenotype, gene expression, cardiac muscle, nerve and liver differentiation) differences, and to explore the expression level and in vitro dry primary amniotic epithelial cell marker SSEA-4 cultured cell phenotype and differentiation ability changes of relevance.
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本文編號(hào)：1376708