本文關(guān)鍵詞：體外持續(xù)傳代對人胎兒來源干細胞生物學特性影響的研究　出處：《大連醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：研究體外持續(xù)傳代對兩種人胎兒來源干細胞（臍帶間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞）基本特性、致瘤性及干性等生物學特性的影響，為干細胞的質(zhì)量監(jiān)控提供實驗依據(jù)。 方法：使用相同方法分離獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細胞（n=3）和羊膜上皮細胞（n=8）進行持續(xù)傳代培養(yǎng)，研究第7、14和21代臍帶間充質(zhì)干細胞基本特性（形態(tài)、增殖、細胞周期、凋亡和衰老）、致瘤性（染色體數(shù)量和致瘤基因表達）以及干性（表型、干性基因表達、心肌、神經(jīng)和肝分化能力）的差別，并探討原代羊膜上皮細胞干性標志物SSEA-4的表達水平與體外培養(yǎng)后細胞表型以及分化能力變化的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果： 1.持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響 1）持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞基本特性的作用規(guī)律 初代的臍帶間充質(zhì)干細胞呈長梭形，隨著傳代次數(shù)的增加，部分細胞變得寬大，細胞增殖速率下降，出現(xiàn)了S和G2期阻滯現(xiàn)象，但三個代數(shù)細胞間無統(tǒng)計學差異。此外，三個代數(shù)細胞均未發(fā)生明顯凋亡：活細胞（Annexin V-/PI-細胞）比例均超過90%，無統(tǒng)計學差異。然而，與第7代及第14代相比，第21代衰老細胞比例顯著增高（P7：0.032±0.018；P14:0.062±0.038；P21:0.229±0.019）。衰老相關(guān)的P21基因表達也顯著升高（P21：0.050±0.020，P14：0.007±0.001，P7：0.010±0.004）（P0.05）。上述實驗結(jié)果表明，第14代以內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細胞能夠較好地保持其基本特性，而第21代細胞則出現(xiàn)了明顯衰老。 2）持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞致瘤性的作用規(guī)律 三個代數(shù)細胞染色體數(shù)量未發(fā)生變化，癌基因E-Ras的表達無統(tǒng)計學差異。然而，第21代癌基因c-Myc（0.047±0.005）的表達則顯著高于第7（0.014±0.006）和14代（0.011±0.002）（P0.05）。這些結(jié)果表明，盡管第21代細胞染色體數(shù)量正常，但癌基因的表達會出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示高代數(shù)細胞可能具有較高的致瘤性。 由于第21代細胞衰老和癌基因表達均顯著升高，因此在之后的干性研究中只選擇使用第7和第14細胞。 3）持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞干性的作用規(guī)律 三個代數(shù)細胞的間充質(zhì)干細胞典型的表面標志物（CD73、CD90和CD105）表達均高于99%，不表達造血干細胞標記物HLA-DR和CD45，各代數(shù)無統(tǒng)計學差異。與第7代細胞相比，，第14代細胞的干性基因Oct3/4（P7：2.378E-5±1.347E-5，P14：1.955E-5±3.692E-6）、Nanog（P7：1.063E-5±5.722E-6，P14：6.517E-6±2.666E-6）、Vimentin （P7：0.507±0.144，P14：0.323±0.041），外胚層祖細胞標志物Nestin（P7：9.421E-4±2.011E-4，P14：6.952E-4±2.906E-4）和中胚層祖細胞標志物GATA4（P7：3.215E-5±3.716E-5，P14：5.082E-6±5.293E-6）的表達有下調(diào)趨勢，內(nèi)胚層祖細胞標志物AFP（P7：5.891E-5±2.439E-5，P14：9.916E-5±2.620E-5）有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學差異。另外，心肌誘導分化實驗結(jié)果顯示：第7代細胞的心肌標志物α-actinin的蛋白表達（0.111±0.030）顯著高于第14代（0.033±0.006）細胞（P0.05），這說明第7代細胞具有較高的心肌分化能力。神經(jīng)誘導分化實驗結(jié)果則顯示：第14代細胞中Nestin（27.2±12.0%）、β-tubulin Ⅲ（70.4±4.5%）陽性細胞的比例較之第7代（Nestin：20.9±0.8%；β-tubulinⅢ：38.6±10.2%）細胞表達升高， β-tubulin Ⅲ有統(tǒng)計學差異（P0.05）， Nestin無統(tǒng)計學差異（P0.05），這說明第14代細胞具有較高的神經(jīng)分化能力。此外，早期肝誘導分化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7代細胞的肝功能標志物Albumin的基因（P7：16.433±12.921，P14：12.967±1.358）（P0.05）及蛋白表達（P7：0.382±0.270，P14：0.260±0.127）有高于P14代的趨勢，但無統(tǒng)計學差異，提示第7代細胞可能具有較高的肝分化潛能，但受到個體差異的影響。 2.持續(xù)傳代對羊膜上皮細胞生物學特性的影響 流式細胞儀分析表明，不同樣本來源的原代羊膜上皮細胞干性標志物SSEA-4的表達在26.7%-97%之間，存在很大的個體差異。第2代細胞與原代細胞相比，SSEA-4表達水平明顯降低，其下降程度與原代細胞SSEA-4的表達水平無關(guān)。另外，傳代培養(yǎng)后羊膜上皮細胞的心肌分化潛能也存在很大個體差異，且其差異與原代細胞SSEA-4表達水平的高低無關(guān)。 結(jié)論： 1.第14代之內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細胞較好地保持了其基本特性，未發(fā)生明顯衰老，且具有較低的癌基因表達，因此更適合再生醫(yī)學研究與應用。 2.臍帶間充質(zhì)干細胞分化實驗表明，盡管受到個體差異的影響，但是體外持續(xù)傳代對不同分化方向有不同的作用規(guī)律，較低代數(shù)細胞的心肌及肝分化能力可能較高，而較高代數(shù)細胞的神經(jīng)分化能力可能較強，因此在具體應用中需要考慮體外傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞具體分化方向及能力的影響，盡可能選擇適合代數(shù)的細胞，同時加強干細胞的質(zhì)量監(jiān)控，以提高安全性和有效性。 3.不同樣本來源的原代羊膜上皮細胞的SSEA-4表達水平受到個體差異的影響，需要建立更準確的臨床樣本篩選指標來穩(wěn)定獲得原代高表達SSEA-4的胎兒樣本，以實現(xiàn)對羊膜上皮細胞的質(zhì)量監(jiān)控。另外，體外培養(yǎng)過程中SSEA-4的表達水平受到培養(yǎng)條件的影響，需要繼續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)條件以維持其高表達。此外，羊膜上皮細胞向心肌樣細胞分化的能力受到樣本個體差異以及培養(yǎng)條件的影響，在今后還需要進一步研究。
[Abstract]:Objective: To study the effects of continuous passage on biological characteristics of two human fetal stem cells (umbilical cord mesenchymal stem cells and amniotic epithelial cells), including tumorigenicity and dry matter, and provide experimental basis for quality monitoring of stem cells.
Methods: using the same method of isolated primary human umbilical cord mesenchymal stem cells (n=3) and human amniotic epithelial cells (n=8) were continuously subcultured on the 7,14 and the 21 generation of human umbilical cord mesenchymal stem cells basic characteristics (morphology, proliferation, cell cycle, apoptosis and senescence), tumorigenicity (chromosome number and tumorigenic gene expression) and dry (dry phenotype, gene expression, cardiac muscle, nerve and liver differentiation) differences, and to explore the expression level and in vitro dry primary amniotic epithelial cell marker SSEA-4 cultured cell phenotype and differentiation ability changes of relevance.
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本文編號：1376708