本文關(guān)鍵詞：肽脫甲酰基酶的表達(dá)純化及其抑制劑的研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 肽脫甲�；�(PDF, peptide deformylase)是篩選新型抗生素的一個(gè)理想靶點(diǎn),其抑制劑的研究引起了廣泛的關(guān)注。在本研究中,通過不同的表達(dá)純化方法,獲得穩(wěn)定性好、活性高的大腸桿菌和金黃色葡萄菌的PDF,建立PDF抑制劑的篩選模型。檢測(cè)其抑制劑對(duì)兩種PDF的抑制效果,同時(shí)檢測(cè)PDF抑制劑的最小抑菌濃度(MIC, minimal inhibitory concentration),對(duì)抑制劑進(jìn)行篩選。為PDF性質(zhì)的研究和新型抗生素的篩選奠定良好的基礎(chǔ)。 方法： 1.將大腸桿菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌BL21(DE3)中,對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行摸索,并進(jìn)行PDF蛋白的大量表達(dá)。 2.通過離子交換層析和分子篩層析,對(duì)大腸桿菌PDF進(jìn)行純化。 3.檢測(cè)大腸桿菌PDF的活性及穩(wěn)定性。 4.構(gòu)建金黃色葡萄球菌PDF重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def。 5.將金黃色葡萄球菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸菌BL21(DE3)中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),采用瓊脂糖磁珠對(duì)其進(jìn)行純化,得到不含離子的PDF；在純化過程中加入氯化鎳,得到鎳離子PDF；在表達(dá)和純化過程中加入氯化鐵,得到富含鐵離子的PDF。 6.對(duì)金黃色葡萄球菌三種不同形式的PDF進(jìn)行活性比較,并對(duì)抑制劑篩選模型的條件進(jìn)行摸索,建立合適的篩選模型。 7.檢測(cè)化合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌PDF的ICso值。 8.應(yīng)用微量稀釋法敏感實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)了39種化合物對(duì)4株革蘭陰性菌和4株革蘭陽(yáng)性菌的MIC值。 結(jié)果： 1.在30℃下,經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí),大腸桿菌PDF蛋白在宿主菌中得到大量表達(dá)。1L菌液可表達(dá)蛋白約30mg。 2.經(jīng)過離子交換層析和分子篩層析純化后,得到了高純度的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白。 3.活性檢測(cè)證實(shí)我們得到了活性高、穩(wěn)定性好的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白,可用于PDF抑制劑的篩選。 4.重組菌落PCR鑒定和基因測(cè)序表明,我們成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def。 5.在不同的表達(dá)和純化條件下,得到了高純度的未加入離子的PDF、含鎳離子PDF、富含鐵離子PDF三種不同形式的金黃色葡萄球菌PDF蛋白。 6.金黃色葡萄球菌不含離子PDF、鎳離子PDF和富含鐵離子PDF經(jīng)活性比較發(fā)現(xiàn),富含鐵離子PDF活性最高,并用于體外PDF抑制劑的篩選實(shí)驗(yàn)。 7.檢測(cè)了39種化合物對(duì)大腸桿菌PDF抑制效果,與陽(yáng)性對(duì)照藥物放線酰胺(actinonin)相比較,未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。另外檢測(cè)了19種化合物對(duì)金黃色葡萄球菌PDF的抑制效果,亦未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。 8.在微量稀釋法敏感實(shí)驗(yàn)中,與陽(yáng)性對(duì)照藥慶大霉素相比,所篩選化合物抑菌效果差于慶大霉素,與actinonin相比,BLC-44對(duì)大腸桿菌和克雷伯肺炎桿菌的抑菌效果優(yōu)于actinonin,其他藥物抑菌效果不及actinonin。 結(jié)論： 經(jīng)表達(dá)純化,獲得了穩(wěn)定性好及活性高的大腸桿菌Ni2+-PDF和金黃色葡萄球菌的富含鐵離子PDF蛋白,并建立了PDF抑制劑的篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?duì)化合物進(jìn)行了篩選,與陽(yáng)性對(duì)照藥actinonin相比,未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。在MIC的檢測(cè)中,亦未發(fā)現(xiàn)抑菌效果好藥物。
[Abstract]:Objective:
Peptide deformylase (PDF peptide deformylase) is an ideal target for screening new antibiotics, study its inhibitors has attracted widespread attention. In this study, through the expression of different purification methods, to obtain good stability, high activity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus PDF, screening model detection of PDF inhibitors. The inhibition effect of inhibitors on the two PDF, the simultaneous detection of the minimum inhibitory concentration of PDF inhibitors (MIC, minimal, inhibitory, concentration) were screened. The inhibitor for the study of PDF properties and new antibiotic screening to lay a good foundation.
Method錛，

本文編號(hào)：1374717