本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-486在造血細胞紅系分化中的表達及機制研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮對基因的調(diào)控作用，包括造血干細胞的自我更新和分化過程，但其在造血細胞分化的表達及其對分化的調(diào)控作用并不清楚。 MicroRNA 486（miR 486）首先在人胎肝組織中被鑒定，，因為人胎肝組織是造血增殖分化最旺盛的組織之一，利用經(jīng)典方法從胎肝組織中鑒定的miRNA無疑是高豐度并可能參與造血生成過程調(diào)節(jié)的重要miRNA。miR 486基因組學(xué)分析表明該基因（Gene ID：619554）位于8號染色體Ankyrin 1（Ank 1）基因的第40個內(nèi)含子（8p11.21位點）。Ank 1在肌肉組織、紅細胞及腦組織等組織中廣泛存在，但與造血干細胞調(diào)控的關(guān)系仍然不清楚。本論文將對miR 486在造血干細胞分化中的表達變化及調(diào)控機制進行闡述。 本課題首先利用實時定量PCR（real time PCR）方法檢測了小鼠各臟器及血液中miR 486的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR 486在血液、肌肉和心肌中高表達,并且其在造血細胞中表達量最高。我們課題組前期研究工作基礎(chǔ)：在比較慢性粒細胞白血�。–ML）和正常CD34+細胞MicroRNA表達譜時發(fā)現(xiàn)miR 486在CML CD34+細胞高表達，進一步證明miR 486與CML BCR ABL融合基因的促紅系分化相關(guān)。第二，分離人臍帶血CD34+細胞，并在含有不同造血生長因子組合的培養(yǎng)體系中進行分化誘導(dǎo)并利用流式細胞儀檢測造血細胞分化效率，同步利用RT QPCR方法檢測miR 486的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著造血干細胞向紅系分化，miR 486表達水平隨之增高；第三，文獻調(diào)研顯示：GATA1是第一個被識別也是最重要的GATA家族因子，在紅系細胞中大量表達，同時也是在紅系分化和成熟過程中起關(guān)鍵作用的中心轉(zhuǎn)錄因子，許多具有紅系特異功能的基因均受GATA1的調(diào)控。我們通過慢病毒介導(dǎo)的GATA1沉默策略，沉默臍帶血CD34+細胞GATA1的表達，并同步檢測miR 486的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA1的沉默效率可以達到82%，可以有效阻斷CD34+細胞向紅系分化，同時miR 486的表達水平也明顯降低。克隆形成實驗,第10天時計數(shù)紅系集落，對照組紅系集落數(shù)為54±4.89，GATA1沉默組紅系集落數(shù)為16±5，P＜0.05，結(jié)果表明GATA1沉默抑制臍帶血CD34+細胞的紅系分化，與分化實驗結(jié)果相符。以上結(jié)果均證明了miR 486在造血干細胞紅系分化過程中起到重要的作用。 MicroRNA通過3’UTR調(diào)控靶基因表達并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。單一MicroRNA可以調(diào)控多個靶基因的表達，而單一靶基因也可受到多個MicroRNA的調(diào)控。通過靶基因的分析可以預(yù)測MicroRNA的生物學(xué)功能。我們利用Targetscan6.2檢索發(fā)現(xiàn)miR 486存在多個預(yù)測靶基因，其中FOXO1，PTEN，ARID4B等與白血病發(fā)病密切相關(guān)。為此我們克隆了ARID4B基因的3′UTR并構(gòu)建了PGL 3M熒光素酶報告載體,將報告載體和miR 486表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，并測定熒光素酶報告活性。結(jié)果以對照組MCS的相對熒光強度為1，miR 486組相對熒光強度為0.631±0.083，miR 486組熒光強度降低了37%。以上結(jié)果表明miR 486有可能通過抑制ARID4B發(fā)揮生物學(xué)功能。 綜上，本研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論：miR 486參與造血干細胞分化的調(diào)節(jié)，是一種與紅系造血分化密切相關(guān)的microRNA，并有可能通過其靶基因ARID4B發(fā)揮生物學(xué)功能。
[Abstract]:MicroRNA ( miRNA ) is a kind of non - coding single - stranded RNA molecule with a length of about 22 nucleotides encoded by endogenous gene . miRNA plays a role in regulating gene regulation after transcription and transcription , including self - renewal and differentiation of hematopoietic stem cells , but its expression in hematopoietic cell differentiation and its regulation on differentiation are not clear .

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本文編號：1373559