本文關鍵詞：治療性應用于移植的調節(jié)性T細胞的體外擴增及共刺激分子B7-1和B7-2對調節(jié)性T細胞發(fā)育和體內穩(wěn)態(tài)影響　出處：《華中科技大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 第一部分天然調節(jié)性T細胞的分離及兩種體外擴增方法的比較 【目的】平行對比分析使用抗體或骨髓分化的樹突狀細胞(bonemarrow deriveddendritic cell，BM-DC)體外擴增天然調節(jié)性T細胞(Treg)的的效率和擴增質量。 【方法】將Treg用生物素偶聯(lián)的抗體anti-CD25標記后用一步陽性分選法從卵清蛋白(ovalbumin，OVA)特異性TCR轉基因小鼠DO11．10外周淋巴組織分離，分別用功能性抗CD3和抗CD28抗體(anti-CD3／CD28)或加載OVA多肽的同系骨髓分化的樹突狀細胞(bone marraw derived dendritic cell，BM-DC)在高濃度外源性IL-2的輔助下刺激增殖1～4周。檢測2種方案的細胞擴增倍數(shù)，擴增細胞的活性和純度，特征性細胞表型以及免疫學特性。 【結果】兩種方案均可以擴增出純度＞90％CD4~+Foxp3~+Treg，雖然擴增的Treg均高表達CD25和Foxp3且保持了Treg的無反應性和特殊的細胞因子分泌譜(不分泌或低分泌IL-2和IFN-γ，高分泌IL-10)，但DC方案的擴增效率更高，擴增的Treg具有更好的活性和純度 【結論】同系骨髓分化的樹突狀細胞比抗CD3和抗CD28抗體對Treg具有更高的擴增效率和擴增質量 第二部分擴增調節(jié)性T細胞體內外抑制同種異體免疫反應能力的分析比較 【目的】平行比較2種方案擴增的Treg在體內和體外抑制同種異體抗原的直接提呈和間接提呈引發(fā)的免疫排斥反應的能力。 【方法】體外功能試驗中，將擴增的Treg加入到模擬體內移植物抗宿主病(graftversus host disease，GVHD)和宿主抗移植物病(host versues graft disease，HVGD)直接和間接抗原提呈的3種混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中：①BABL/c DC／OVA+B6 CD4~+T，②B6 DC+BABL／c CD4~+T+BABL／c DC／OVA和③Ba DC／OVA／B6 Ag+B6 CD4~+T，檢測其免疫抑制活性；在體內功能試驗中，擴增Treg和B6 DC過繼性輸注到預先植入OVA滲透泵的BABL／c小鼠體內，5天后獲取淋巴細胞用B6 DC進行繼發(fā)性刺激檢測Treg的免疫抑制活性。用流式儀檢測細胞增殖和分泌IFN-γ的效應T細胞比例，用ELISA試劑盒檢測上清中的細胞因子IL-2和IFN-γ含量。 【結果】與抗體擴增的Treg相比，，雖然BM-DC擴增的Treg抑制同種異體反應性T細胞增殖的能力略弱，但卻能更有效地阻斷同種異體反應性T細胞向分泌IFN-γ的效應細胞分化。只有BM-DC擴增的Treg可以在體內存活并抑制宿主對同種異體抗原刺激的免疫反應。 【結論】BM-DC擴增的Treg能更適合于器官移植領域的治療性應用 第三部分共刺激分子B7-1和B7-2對天然調節(jié)性T細胞發(fā)育和體內穩(wěn)態(tài)影響 【目的】研究共刺激分子B7-1和B7-2對Freg在胸腺內發(fā)育和外周內環(huán)境穩(wěn)定的相對作用，為改進阻斷CD28／B7共刺激信號通路的移植耐受方案提供參考。 【方法】用流式細胞儀對比分析野生型及B7-1或(和)B7-2敲除B6小鼠胸腺和外周淋巴組織中CD4~+CD25~+Foxp3~+T細胞的比例，并比較從野生型和B7分子敲除小鼠獲得的骨髓分化的樹突狀細胞(BM-DC)在體外維持和擴增Treg的能力以及刺激同種異體免疫反應的能力。 【結果】雖然B7-1或B7-2的缺失都可引起胸腺內Treg比例下降30％，但是B7-2可維持外周85％的Treg，而B7-1僅能維持65％。另一方面缺乏B7-2而非B7-1提供的共刺激信號可以有效阻斷DC刺激同種異體反應T細胞的能力。 【結論】雖然B7-2在維持調節(jié)性T細胞外周內環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮更重要作用，但與完全切斷CD28／B7共刺激通路相比，選擇性阻斷B7-2可以有效地抑制同種異體免疫排斥反應同時對調節(jié)性T細胞的影響較小。
[Abstract]:Isolation of the first part of natural regulatory T cells and comparison of two methods of in vitro amplification Objective : To compare the efficiency and amplification quality of natural regulatory T cells ( Treg ) in vitro using antibody or bone marrow differentiated dendritic cells ( BM - DC ) in vitro . Methods : Treg - conjugated antibody anti - CD25 was labeled with anti - CD25 and isolated from peripheral lymphoid tissues of mouse DO11.10 with anti - CD3 and anti - CD28 antibodies or OVA - loaded dendritic cells ( BM - DC ) . The cells were stimulated to proliferate for 1 - 4 weeks with the aid of anti - CD3 and anti - CD28 antibodies or OVA - loaded dendritic cells . Both schemes can amplify the purity of CD4 ~ + Foxp3 ~ + Treg , although the amplified Treg can express CD25 and Foxp3 and maintain the non - reactive and special cytokine secretion spectrum of Treg ( secretion or low secretion of IL - 2 and IFN - 緯 , high secretion of IL - 10 ) , but the amplification efficiency of DC scheme is higher , and the amplified Treg has better activity and purity . Conclusion Compared with anti - CD3 and anti - CD28 anti - CD3 and anti - CD28 antibodies , the dendritic cells differentiated from bone marrow have higher amplification efficiency and amplification quality than anti - CD3 and anti - CD28 antibodies . Comparative analysis of the ability of the second part to amplify the ability of allogeneic immune response in vitro and outside the regulatory T cell body The purpose of this study was to compare the ability of Treg amplified by two protocols to inhibit the direct and indirect extraction of alloantigen in vivo and in vitro . In vitro function test , the amplified Treg was added to three kinds of mixed lymphocyte culture systems : 鈶

本文編號：1372655