本文關(guān)鍵詞：持續(xù)表達HCV全基因組小鼠模型的建立　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 丙型病毒性肝炎 動物模型 水動力轉(zhuǎn)染 噬菌體整合酶

【摘要】： 丙型病毒性肝炎是一種嚴重危害人類健康的疾病。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)急性感染后75%-85%轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?其中的10%-20%發(fā)展成肝硬化,且與肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前認為HCV感染后的慢性化機制歸因于機體免疫功能的紊亂,肝細胞損傷的發(fā)生與免疫細胞及細胞因子在肝臟局部組織的浸潤有關(guān),但由于缺少合適的小動物模型,所以對HCV致病機制以及機體免疫系統(tǒng)所發(fā)揮的作用還缺乏深入的理解。因此探索一種具有實際應(yīng)用價值的HCV全基因組表達模型具有非常重要的意義。 本課題基于成年小鼠,聯(lián)合應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)與噬菌體整合酶系統(tǒng),建立持續(xù)表達HCV全基因組小鼠的模型,作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的補充或替代,可用于觀察HCV長期表達引起免疫系統(tǒng)的變化及其與肝損傷的關(guān)系。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下: 1.雙順反子表達質(zhì)粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV)的構(gòu)建與鑒定。 以高效表達載體pCI-attB-AerApoEAATP為構(gòu)架,該載體含有肝臟特異性調(diào)控序列組合AerApoEAATP(AAA)與噬菌體整合酶φC31-int識別位點attB,報告基因Fluc的表達活性反映了HCV全基因組的表達水平,將基因Fluc、EMCV IRES、HCV全功能基因依次連在啟動子AerApoEAATP后面,構(gòu)建 依賴帽子的掃描機制‖翻譯表達Fluc, 非依賴帽子的掃描機制‖—EMCV IRES介導(dǎo)HCV全功能基因翻譯的雙順反子表達質(zhì)粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV); 2. HCV全基因組在小鼠體內(nèi)瞬時表達模型的建立 水動力轉(zhuǎn)染方法是指從小鼠尾靜脈快速(4-8s)注射大體積(達小鼠體重的8%-12%)含目的基因的生理鹽水,從而實現(xiàn)外源基因在小鼠體內(nèi)(尤其是肝臟內(nèi))的高效表達;應(yīng)用此技術(shù)將表達載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCVIRES-HCV轉(zhuǎn)染到具有正常免疫系統(tǒng)的Balb/c小鼠肝細胞內(nèi),以Fluc作為HCV全基因組的內(nèi)參,通過活體熒光成像技術(shù)實時動態(tài)檢測初步證實了HCV全基因組在小鼠體內(nèi)得到表達,繼而又通過RT-PCR、Western-blotting和免疫組織化學方法從RNA水平和蛋白水平進一步得到證實。但是要對病毒性肝炎慢性化機制進行研究,以及抗病毒藥物在體內(nèi)的長期作用效果進行評價,此模型存在明顯的不足,所以如何延長HCV在小鼠體內(nèi)的表達時間顯得尤為重要。 3.HCV全基因組在小鼠體內(nèi)長期表達模型的建立 噬菌體φC31整合酶是一種高效的整合工具酶,可以有效地將含有attB位點的質(zhì)粒整合到含有attP同源序列的小鼠細胞基因組中去,所以我們利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)及噬菌體整合酶系統(tǒng)來實現(xiàn)目的基因在小鼠體內(nèi)肝細胞中長期穩(wěn)定表達。 通過水動力轉(zhuǎn)染法將表達載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES -HCV及對照載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc分別與編碼野生型φC31-int的表達載體pCMV-int共轉(zhuǎn)染至Balb/c小鼠體內(nèi)。在φC31-int作用下,表達框架整合到小鼠肝臟染色體上,在小鼠肝臟獲得長期表達,在共轉(zhuǎn)染后表達可長達90d以上。對獲得長期穩(wěn)定表達Fluc和HCV全基因組的小鼠分別行2/3肝臟切除術(shù),肝切除后Fluc活性迅速下降,但是活體熒光成像顯示僅表達Fluc的對照組小鼠兩周后Fluc的表達量隨肝臟組織再生而逐漸恢復(fù),而表達HCV全基因組的實驗組小鼠Fluc的表達量并沒有隨著術(shù)后時間的延長而恢復(fù),所以我們對φC31-int介導(dǎo)下獲得外源基因長期表達的小鼠是否整合繼續(xù)鑒定,針對小鼠染色體上特異性整合位點中的熱點—mpsL1設(shè)計引物,提取肝臟基因組進行nest-PCR,結(jié)果證實HCV全基因組表達框架在小鼠第2號染色體的mpsL1位點處發(fā)生位點特異性整合,生成兩個雜合位點attR和attL,整合鉸鏈區(qū)(core area)為TG,且有1-8個堿基的丟失,通過整合位點的正確鑒定說明HCV全基因組已經(jīng)整合到小鼠染色體上并得到較長時期的表達。既然外源基因已經(jīng)在小鼠體內(nèi)得到整合,但HCV全基因組并沒有隨著術(shù)后時間的延長而恢復(fù),說明HCV全基因組的整合可能抑制了肝臟的再生。 總之,本研究通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)及噬菌體整合酶系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用,建立了HCV全基因組小鼠體內(nèi)長期表達模型,可用于研究丙型病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展演變及轉(zhuǎn)歸的整個過程,同時可了解免疫系統(tǒng)在整個致病過程中所發(fā)揮的作用,為今后抗HCV的疫苗篩選、藥物評價和后期臨床治療奠定良好的基礎(chǔ)。但是優(yōu)化整合條件,提高整合效率,提高外源基因在小鼠體內(nèi)的表達活性和穩(wěn)定性仍然是今后工作需要解決的重要問題。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R-332

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本文編號：1369962