本文關(guān)鍵詞：持續(xù)表達(dá)HCV全基因組小鼠模型的建立　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)急性感染后75%-85%轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?其中的10%-20%發(fā)展成肝硬化,且與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前認(rèn)為HCV感染后的慢性化機(jī)制歸因于機(jī)體免疫功能的紊亂,肝細(xì)胞損傷的發(fā)生與免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在肝臟局部組織的浸潤(rùn)有關(guān),但由于缺少合適的小動(dòng)物模型,所以對(duì)HCV致病機(jī)制以及機(jī)體免疫系統(tǒng)所發(fā)揮的作用還缺乏深入的理解。因此探索一種具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的HCV全基因組表達(dá)模型具有非常重要的意義。 本課題基于成年小鼠,聯(lián)合應(yīng)用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)與噬菌體整合酶系統(tǒng),建立持續(xù)表達(dá)HCV全基因組小鼠的模型,作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的補(bǔ)充或替代,可用于觀察HCV長(zhǎng)期表達(dá)引起免疫系統(tǒng)的變化及其與肝損傷的關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下: 1.雙順反子表達(dá)質(zhì)粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV)的構(gòu)建與鑒定。 以高效表達(dá)載體pCI-attB-AerApoEAATP為構(gòu)架,該載體含有肝臟特異性調(diào)控序列組合AerApoEAATP(AAA)與噬菌體整合酶φC31-int識(shí)別位點(diǎn)attB,報(bào)告基因Fluc的表達(dá)活性反映了HCV全基因組的表達(dá)水平,將基因Fluc、EMCV IRES、HCV全功能基因依次連在啟動(dòng)子AerApoEAATP后面,構(gòu)建 依賴帽子的掃描機(jī)制‖翻譯表達(dá)Fluc, 非依賴帽子的掃描機(jī)制‖—EMCV IRES介導(dǎo)HCV全功能基因翻譯的雙順反子表達(dá)質(zhì)粒(pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES-HCV); 2. HCV全基因組在小鼠體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)模型的建立 水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法是指從小鼠尾靜脈快速(4-8s)注射大體積(達(dá)小鼠體重的8%-12%)含目的基因的生理鹽水,從而實(shí)現(xiàn)外源基因在小鼠體內(nèi)(尤其是肝臟內(nèi))的高效表達(dá);應(yīng)用此技術(shù)將表達(dá)載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCVIRES-HCV轉(zhuǎn)染到具有正常免疫系統(tǒng)的Balb/c小鼠肝細(xì)胞內(nèi),以Fluc作為HCV全基因組的內(nèi)參,通過活體熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)初步證實(shí)了HCV全基因組在小鼠體內(nèi)得到表達(dá),繼而又通過RT-PCR、Western-blotting和免疫組織化學(xué)方法從RNA水平和蛋白水平進(jìn)一步得到證實(shí)。但是要對(duì)病毒性肝炎慢性化機(jī)制進(jìn)行研究,以及抗病毒藥物在體內(nèi)的長(zhǎng)期作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià),此模型存在明顯的不足,所以如何延長(zhǎng)HCV在小鼠體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間顯得尤為重要。 3.HCV全基因組在小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)模型的建立 噬菌體φC31整合酶是一種高效的整合工具酶,可以有效地將含有attB位點(diǎn)的質(zhì)粒整合到含有attP同源序列的小鼠細(xì)胞基因組中去,所以我們利用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)及噬菌體整合酶系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)目的基因在小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。 通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法將表達(dá)載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-EMCV IRES -HCV及對(duì)照載體pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc分別與編碼野生型φC31-int的表達(dá)載體pCMV-int共轉(zhuǎn)染至Balb/c小鼠體內(nèi)。在φC31-int作用下,表達(dá)框架整合到小鼠肝臟染色體上,在小鼠肝臟獲得長(zhǎng)期表達(dá),在共轉(zhuǎn)染后表達(dá)可長(zhǎng)達(dá)90d以上。對(duì)獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)Fluc和HCV全基因組的小鼠分別行2/3肝臟切除術(shù),肝切除后Fluc活性迅速下降,但是活體熒光成像顯示僅表達(dá)Fluc的對(duì)照組小鼠兩周后Fluc的表達(dá)量隨肝臟組織再生而逐漸恢復(fù),而表達(dá)HCV全基因組的實(shí)驗(yàn)組小鼠Fluc的表達(dá)量并沒有隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而恢復(fù),所以我們對(duì)φC31-int介導(dǎo)下獲得外源基因長(zhǎng)期表達(dá)的小鼠是否整合繼續(xù)鑒定,針對(duì)小鼠染色體上特異性整合位點(diǎn)中的熱點(diǎn)—mpsL1設(shè)計(jì)引物,提取肝臟基因組進(jìn)行nest-PCR,結(jié)果證實(shí)HCV全基因組表達(dá)框架在小鼠第2號(hào)染色體的mpsL1位點(diǎn)處發(fā)生位點(diǎn)特異性整合,生成兩個(gè)雜合位點(diǎn)attR和attL,整合鉸鏈區(qū)(core area)為TG,且有1-8個(gè)堿基的丟失,通過整合位點(diǎn)的正確鑒定說明HCV全基因組已經(jīng)整合到小鼠染色體上并得到較長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)。既然外源基因已經(jīng)在小鼠體內(nèi)得到整合,但HCV全基因組并沒有隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而恢復(fù),說明HCV全基因組的整合可能抑制了肝臟的再生。 總之,本研究通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)及噬菌體整合酶系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用,建立了HCV全基因組小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)模型,可用于研究丙型病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展演變及轉(zhuǎn)歸的整個(gè)過程,同時(shí)可了解免疫系統(tǒng)在整個(gè)致病過程中所發(fā)揮的作用,為今后抗HCV的疫苗篩選、藥物評(píng)價(jià)和后期臨床治療奠定良好的基礎(chǔ)。但是優(yōu)化整合條件,提高整合效率,提高外源基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)活性和穩(wěn)定性仍然是今后工作需要解決的重要問題。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R-332

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