本文關鍵詞：二硫化碳對共培養(yǎng)大鼠睪丸支持—生精細胞凋亡和凋亡相關蛋白表達的影響　出處：《華中科技大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 二硫化碳 睪丸 支持-生精細胞共培養(yǎng) 細胞凋亡 Fas系統(tǒng) P53 Bcl-2

【摘要】： 二硫化碳(CS2)是一種應用廣泛的有機溶劑。對男(雄)性影響的報道主要表現(xiàn)為性功能由亢進到減退,精子數(shù)減少,活動力下降和畸形精子數(shù)增多等。但有關CS2對男(雄)性生殖損傷作用機制的研究鮮有報道。本實驗以共培養(yǎng)大鼠睪丸支持-生精細胞為研究對象,初步探討CS2對大鼠睪丸細胞凋亡作用和凋亡相關蛋白表達的影響,為揭示其基因調(diào)控機制,闡明CS2生殖毒性的作用機制提供科學依據(jù)。 本實驗通過建立大鼠睪丸支持-生精細胞共培養(yǎng)體系,運用Feulgen氏核染色法對支持細胞和生精細胞進行鑒定,然后以CS2作為受試物,對共培養(yǎng)大鼠支持-生精細胞進行染毒,用MTT比色法檢測其對共培養(yǎng)細胞存活率的影響。用TUNEL法檢測支持細胞和生精細胞的凋亡指數(shù),并用Western blot方法對不同濃度CS2處理過的共培養(yǎng)細胞P53和Bcl-2蛋白進行半定量檢測,用免疫細胞化學方法對不同濃度CS2處理過的共培養(yǎng)細胞Fas和FasL蛋白進行定位以及粗定量。 實驗結果表明,本實驗方法建立的大鼠睪丸支持-生精細胞共培養(yǎng)體系,在不添加任何細胞因子的條件下,生精細胞能夠貼附于支持細胞層上生長,并在體外較長時間共生。在CS2作用下,細胞相對存活率隨染毒濃度的增高而降低,當CS2濃度≥100μmol/L時,共培養(yǎng)的支持細胞與生精細胞相對存活率明顯降低(P0.05)。凋亡指數(shù)亦隨染毒濃度的增高而增大(P0.05和P0.01)。P53和Bcl-2蛋白表達水平均隨CS2染毒濃度增高而增高,各CS2濃度組P53蛋白表達水平均顯著高于對照組(P0.05),100μmol/L和200μmol/L濃度組Bcl-2蛋白表達水平也顯著高于對照組(P0.05)。各CS2濃度組Fas和FasL的表達量較對照組明顯增高。 從以上結果可以看出:在本實驗建立的體外共培養(yǎng)體系中,生精細胞可以貼附與支持細胞層上生長,并與之較長時間在體外共生,Feulgen氏核染色法用于鑒定支持細胞和生精細胞簡單、易行,我們認為這個培養(yǎng)體系和鑒定方法為深入研究化學物質(zhì)對支持細胞和生精細胞的生殖毒性及毒作用機制提供了細胞模型;CS2對體外共培養(yǎng)的支持-生精細胞具有細胞毒作用,可使細胞存活率下降,細胞凋亡率增高,最終導致精子數(shù)量減少;CS2可誘導共培養(yǎng)大鼠支持-生精細胞P53、Bcl-2、Fas及FasL的表達,Fas和FasL表達上調(diào),啟動Fas系統(tǒng)使生精細胞發(fā)生凋亡,P53的表達增高進一步促使凋亡的發(fā)生,而Bcl-2的高表達可能是為抑制凋亡的發(fā)生而產(chǎn)生的保護性反應。因此P53、Bcl-2和Fas系統(tǒng)參與了CS2誘導支持細胞和生精細胞凋亡的基因調(diào)控過程,這為進一步探討其基因調(diào)控機制,闡明CS2致男(雄)性生殖損傷的機理,保護職業(yè)人群的健康提供了科學依據(jù)。
[Abstract]:Carbon disulfide (CS2) is a widely used organic solvent. The effect of CS2 on male (male) sex is mainly characterized by sexual function from hyperactivity to decline, and the number of spermatozoa decreases. However, there are few reports on the mechanism of male (male) reproductive injury caused by CS2. In this study, Sertoli and spermatogenic cells of rat testis were co-cultured. To explore the effect of CS2 on apoptosis and expression of apoptosis-related protein in rat testicular cells, and to provide scientific basis for revealing the mechanism of gene regulation and elucidating the mechanism of reproductive toxicity of CS2. In this experiment, the Sertoli cells and spermatogenic cells of rat testis were identified by Feulgen's nuclear staining method, and then CS2 was used as the test material through the establishment of rat testicular Sertoli and spermatogenic cells co-culture system. The survival rate of co-cultured rat spermatogenic cells was determined by MTT colorimetry, and the apoptosis index of Sertoli cells and spermatogenic cells was detected by TUNEL assay. The p53 and Bcl-2 proteins of co-cultured cells treated with different concentrations of CS2 were detected by Western blot. The Fas and FasL proteins of co-cultured cells treated with different concentrations of CS2 were localized and quantified by immunocytochemistry. The results showed that the spermatogenic cells could grow on the Sertoli cell layer without adding any cytokines in the co-culture system of rat testicular Sertoli cells. Under the action of CS2, the relative survival rate of cells decreased with the increase of the concentration of CS2, when the concentration of CS2 was more than 100 渭 mol/L. The relative survival rate of Sertoli cells and spermatogenic cells in co-cultured Sertoli cells was significantly lower than that in Spermatogenic cells. The apoptosis index also increased with the increase of exposure concentration (P0.05 and P0.01). The expression of p53 and Bcl-2 protein increased with the increase of CS2 concentration. The expression of p53 protein in each CS2 group was significantly higher than that in the control group (P 0.05). The expression of Bcl-2 protein in the 100 渭 mol/L and 200 渭 mol/L groups was also significantly higher than that in the control group (P0.05). The expression of Fas and FasL in each CS2 group was significantly higher than that in the control group. From the above results, we can see that in the co-culture system in vitro, spermatogenic cells can be attached to the Sertoli cell layer and grow with it for a long time in vitro symbiosis. Feulgen's nuclear staining is simple and easy to identify Sertoli cells and spermatogenic cells. We believe that this culture system and identification method provide a cell model for the further study of the reproductive toxicity and toxic mechanism of chemicals to Sertoli cells and spermatogenic cells. CS2 has cytotoxic effect on spermatogenic cells co-cultured in vitro, which can decrease the cell survival rate, increase the apoptosis rate, and eventually lead to a decrease in the number of spermatozoa. CS2 could induce the up-regulation of expression of FAS and FasL in spermatogenic cells of co-cultured rat spermatogenic cells, and induce apoptosis of spermatogenic cells by activating Fas system. The high expression of p53 may promote the occurrence of apoptosis, while the high expression of Bcl-2 may be a protective response to inhibit the occurrence of apoptosis. Bcl-2 and Fas system are involved in the gene regulation of Sertoli cell and spermatogenic cell apoptosis induced by CS2. To elucidate the mechanism of male (male) reproductive injury induced by CS2 and to provide scientific basis for the protection of occupational health.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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