本文關(guān)鍵詞：鑒定分析與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ, TGFβ)超家族的成員之一,最初因為其能誘導(dǎo)骨和軟骨的形成而得名,目前認(rèn)為,BMPs與系統(tǒng)發(fā)育中的細(xì)胞增殖和分化有關(guān),BMPs可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨、肌腱和脂肪分化。至今共分離和鑒定了20余種BMPs,主要已報道的具有誘導(dǎo)成骨活性的BMPs為BMP2、5、7等,其中BMP2和BMP7已經(jīng)被用于臨床治療,但在臨床實際應(yīng)用上效果還不能令人滿意。因此,尋找更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子成為目前共同關(guān)注的課題,也是臨床的迫切需要。 在實驗室的前期研究工作中,我們通過重組腺病毒介導(dǎo)的方法,系統(tǒng)研究了BMP2～BMP15共14種BMPs在誘導(dǎo)骨形成中的的作用。采用間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10細(xì)胞系,分別在體外和裸鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)除傳統(tǒng)BMP2、7外,BMP4、6、9也具有誘導(dǎo)成骨作用,其中BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10成骨的作用,遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)應(yīng)用的BMP2和BMP7。BMP9是目前已知的BMPs(包括BMP2、BMP7)中誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)的因子,有希望作為一種更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子替代品,因此具有廣闊的潛在的臨床應(yīng)用價值。 但是,BMP9誘導(dǎo)成骨的機(jī)制目前并不十分清楚。作為TGFβ家族成員,所有的BMPs(包括BMP9)都主要通過TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞信號,發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨的功能。首先BMPs與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的跨膜TGFβⅡ型和Ⅰ型受體結(jié)合,啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo),隨后,磷酸化的Ⅰ型受體激活轉(zhuǎn)錄因子Smads,由激活的Smads調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)。因此,在BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,TGFβ受體起著承上(與BMPs結(jié)合)和啟下(活化Smads)的作用,是BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點,是BMPs早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要的分子之一,與BMPs發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的活性關(guān)系密切。BMP2和BMP7等成骨性BMPs,其相關(guān)的TGFβ受體已經(jīng)被鑒定和分析清楚,但是與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體,目前了解很少,這也限制了對于BMP9誘導(dǎo)成骨機(jī)制的揭示。 基于以上分析,本研究綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實驗動物學(xué)等多項技術(shù),如細(xì)胞培養(yǎng)、基因克隆、基因轉(zhuǎn)染、重組腺病毒、細(xì)胞分化實驗技術(shù)、real time PCR、動物模型、Micro-CT、組織化學(xué)染色等,主要鑒定分析與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體,為BMP9誘導(dǎo)成骨的機(jī)制,在受體水平上提供證據(jù)。整個研究分為兩大部分,主要研究結(jié)果如下: 第一部分研究中,我們分析已知的七種TGFβⅠ型受體和四種TGFβⅡ型受體的核苷酸序列,PCR擴(kuò)增含受體胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域部分的片段,并將片段克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pAdtrace-TO4,通過菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定對陽性克隆進(jìn)行鑒定,得到共11種TGFβ受體相應(yīng)的顯性負(fù)性突變體(dn-receptor)質(zhì)粒;隨后,在BJAdeasy細(xì)菌中同源重組dn-receptor腺病毒質(zhì)粒,重組dn-receptor腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,使腺病毒在其中包裝和擴(kuò)增,最后得到11種dn-receptor重組腺病毒。將制備的dn-receptor腺病毒感染目標(biāo)細(xì)胞C3H10,在感染24小時后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)11種dn-receptor腺病毒均可在C3H10內(nèi)表達(dá)RFP紅色熒光蛋白,產(chǎn)生紅色熒光;在病毒感染C3H10細(xì)胞48小時后,提取細(xì)胞RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,所有11種dn-receptor均可在C3H10細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。通過這部分實驗,我們最終獲得了11種TGFβ受體相應(yīng)的顯性負(fù)性突變體腺病毒,并驗證了其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。顯性負(fù)性突變的TGFβ受體可以與細(xì)胞內(nèi)的野生型受體競爭相應(yīng)配體,抑制配體功能的發(fā)揮。該部分制備的腺病毒用于第二部分實驗,而且也可以用于TGFβ信號通路中與TGFβ受體有關(guān)的相關(guān)研究。 第二部分研究中,首先在體外實驗中,我們利用顯性負(fù)性突變型TGFβ受體腺病毒和BMP9共同作用間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)和鼠成肌細(xì)胞C2C12,通過ALP定性和定量試驗以及熒光素酶報告基因試驗,初步篩選出了5種dn-receptor可以抑制BMP9誘導(dǎo)的ALP和熒光素酶活性,它們分別是dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),它們對于ALP表達(dá)的抑制存在劑量依賴性,而且還可以抑制C3H10和MEFs細(xì)胞的鈣鹽沉積,抑制細(xì)胞的成骨分化;通過Real-time PCR發(fā)現(xiàn)dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB這5dn-receptor可以抑制BMP9靶基因(Smad6,Smad7和Id1)的表達(dá)。將dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB和BMP9共感染C3H10細(xì)胞,在裸鼠皮下進(jìn)行注射,5周后觀察并剝離皮下包塊,Micro-CT掃描和影像重建;石蠟包埋、切片,組織化學(xué)染色觀察包塊內(nèi)細(xì)胞成骨情況,結(jié)果顯示與對照相比,dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB處理組成骨包塊偏小,而且其包塊內(nèi)成骨不活躍,表明dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB可以抑制BMP9誘導(dǎo)的C3H10在裸鼠皮下的成骨。從以上結(jié)果看這五種dn-recepotr相應(yīng)的野生型受體(ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB)很可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)。因此,我們利用pSOS系統(tǒng)篩選了能抑制相應(yīng)受體表達(dá)的siRNA(首先測試了ALK1和ALK2),再利用RNAi抑制ALK1和ALK2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制ALK1和ALK2表達(dá)后,BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性可相應(yīng)被抑制。 綜上所述,本研究從細(xì)胞水平到動物整體水平,全面鑒定分析了可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體,從整個研究中我們得到以下研究結(jié)論: 1. TGFβ受體與BMP9誘導(dǎo)成骨活性密切相關(guān),相應(yīng)dn-receptor可以抑制BMP9誘導(dǎo)的細(xì)胞成骨分化。 2.構(gòu)建和制備的dn-receptor腺病毒可以有效地在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的dn-recepotr,因此,它們不但可以用于BMP9相關(guān)TGFβ受體的研究和分析,也可以用于TGFβ家族其它分子的研究(如BMP13, BMP14,它們對于軟骨形成有重要作用,其相關(guān)的TGFβ受體未知)。 3通過測試C3H10、BMSC、MEFs和C2C12四種細(xì)胞發(fā)現(xiàn):在7種Ⅰ型dn-receptor中,dnALK1和dnALK2能有效抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性和早期成骨指標(biāo)ALP活性;在4種Ⅱ型dn-receptor中,dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性和ALP活性,而且這種抑制作用具有劑量依賴性。 4.進(jìn)一步研究證實,dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導(dǎo)的鈣鹽沉積,并且可抑制BMP9調(diào)控的相關(guān)靶基因基因(Smad6,Smad7,Id1)的表達(dá)。因此,在11種TGFβ受體中,ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)。 5.通過pSOS系統(tǒng)篩選了能有效抑制ALK1、ALK2表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA),發(fā)現(xiàn)在利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制C3H10細(xì)胞種ALK1、ALK2表達(dá)后,繼而可抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性,初步顯示在抑制目標(biāo)細(xì)胞相關(guān)TGFβ受體表達(dá)后,BMP9成骨活性受到了抑制。這提示,繼續(xù)研究細(xì)胞內(nèi)ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB等受體表達(dá)抑制后,對于BMP9誘導(dǎo)成骨效應(yīng)的影響,將有助于闡明BMP9誘導(dǎo)成骨的機(jī)制。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein ( BMPs ) is one of the members of transforming growth factor - 尾 ( TGF - 尾 ) superfamily . The BMPs can regulate the proliferation and differentiation of bone and cartilage . BMPs can regulate the proliferation and differentiation of bone , cartilage , tendon and fat . BMP2 and BMP7 , BMP2 and BMP7 , were used to induce bone formation in vitro and in nude mice . BMPs ( BMPs ) and BMP7 ( BMPs ) are the most important molecules in BMPs signal transduction . Based on the above analysis , this study comprehensively applied several techniques , such as cell culture , gene cloning , gene transfection , recombinant adenovirus , cell differentiation experiment , real time PCR , animal model , Micro - CT , histochemical staining , etc . In the first part , we analyzed the nucleotide sequences of seven types of TGF - 尾 type 鈪，

本文編號：1358722