本文關(guān)鍵詞：人類γδT細(xì)胞抗原表位肽的鑒定和健康人γδT細(xì)胞克隆的建立及鑒定　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 盡管γδT細(xì)胞在機(jī)體抗感染、抗腫瘤的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用,但是目前所發(fā)現(xiàn)的配體抗原僅限于十余種,根本無法與承擔(dān)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的αβT細(xì)胞可識別數(shù)以億萬計的抗原表位肽相比。此外,有關(guān)γδT細(xì)胞的表位蛋白多肽則尚無報道。因此,有必要進(jìn)行γδT細(xì)胞蛋白抗原表位肽的研究,以澄清活化γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一方面,活化的γδT細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的重要效應(yīng)細(xì)胞,一旦獲得具有活化γδT細(xì)胞的抗原表位多肽,可為體內(nèi)外激活γδT細(xì)胞提供一個有效的活化手段。為此,我們所關(guān)注的第一個科學(xué)問題是是否存在人類γδT細(xì)胞的抗原表位?如果存在,多個串聯(lián)抗原表位多肽是否比單個抗原表位肽更具刺激γδT細(xì)胞的能力?圍繞上述兩個科學(xué)問題我們開展了人類γδT細(xì)胞的抗原表位肽的鑒定研究。 我們實驗室先前根據(jù)三個來源于卵巢癌組織浸潤的γδT細(xì)胞的TCRδ鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)3的(CDR3δ)基因序列,合成了三條CDR3δ多肽OT1、OT2、OT3,并且以這三條多肽為探針,在噬菌體隨機(jī)十二肽庫中篩選與CDR3δ多肽結(jié)合的十二肽,作為γδT細(xì)胞的候選抗原表位肽。我們獲得了7個能與探針特異性結(jié)合的候選抗原表位肽。體外實驗表明,這些多肽能在一定程度上增強(qiáng)γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,提示這些多肽具有抗原表位活性。但是,可能由于這些多肽分子量小,因此,它們對γδT細(xì)胞的活化能力較弱。為了增強(qiáng)這些潛在抗原表位肽激活γδT細(xì)胞的能力,我們試圖通過制備串聯(lián)抗原多肽的方式來提高其刺激活性。具體的實驗思路為:通過分子克隆技術(shù),將表位肽串聯(lián),并與無關(guān)載體蛋白GST連接構(gòu)建GST-表位融合蛋白表達(dá)載體,表達(dá)并鑒定了這些GST-表位融合蛋白的功能,以進(jìn)一步闡明該項策略的可行性。 這一研究的主要工作及其結(jié)果如下: 首先,我們通過流式細(xì)胞儀檢測、~3H摻入法、MTT摻入法證實篩選到的十二肽能在一定程度上刺激γδT細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其殺傷腫瘤的作用,提示這些十二肽可能是γδTCR特異性識別的抗原表位肽。這為進(jìn)一步澄清活化γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。 其次,采用同尾酶技術(shù)構(gòu)建了含不同表位組合方式的GST-表位融合蛋白的表達(dá)載體,通過ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測,從分子水平和細(xì)胞水平證實這些原核表達(dá)的重組GST-表位融合蛋白能與探針OT3、OT3(V)-Fc分子及γδT細(xì)胞的TCR特異性結(jié)合。并且,利用CFSE染色和MTT摻入的方法,驗證GST-表位融合蛋白可刺激γδT細(xì)胞群體的增殖作用。此外,GST-表位融合蛋白與γδT細(xì)胞孵育后,發(fā)現(xiàn)它們可以促進(jìn)γδT細(xì)胞的殺傷作用,且GST-串聯(lián)表位融合蛋白的作用要強(qiáng)于GST-單表位融合蛋白。通過半定量RT-PCR和進(jìn)一步的ELISA定量分析,發(fā)現(xiàn)GST-表位融合蛋白能夠促進(jìn)γδT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ,和TNF-α;此外,Fas配體和顆粒酶B的表達(dá)也有所增加。 最后,我們觀察了GST-串聯(lián)表位融合蛋白刺激的人γδT細(xì)胞對荷瘤裸鼠的抑瘤作用。結(jié)果顯示,GST-串聯(lián)表位融合蛋白刺激的人γδT細(xì)胞治療組小鼠腫瘤的生長較未刺激γδT細(xì)胞治療組相比明顯受到抑制,小鼠的生存期也有所延長。 綜上,我們首次系統(tǒng)地驗證了γδT細(xì)胞表位肽的存在。這些表位肽能在一定程度上刺激γδT細(xì)胞增殖,并增強(qiáng)其殺傷腫瘤的作用。其次,通過構(gòu)建GST-表位融合蛋白并進(jìn)行功能實驗證實,串聯(lián)表位肽的γδT細(xì)胞活化效果要優(yōu)于單表位肽。這說明將表位串聯(lián)起來提高表位的γδT細(xì)胞活化能力的新策略是完全可行的。這將為基于γδT細(xì)胞的過繼免疫細(xì)胞治療腫瘤提供新型活化手段。 γδT細(xì)胞是一群特殊的T細(xì)胞,是連接固有免疫和特異性免疫之間不可或缺的橋梁。由于γδT細(xì)胞在外周血中只占很少的比例,分離純化相對較繁瑣,這為深入研究γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能帶來了一定的困難。因此,若能建立在體外可長期培養(yǎng)的γδT細(xì)胞克隆,尤其是建立單個的γδT細(xì)胞克隆,將極大地促進(jìn)其抗原識別、細(xì)胞活化及功能等研究。為此,本文的第二方面工作為健康人γδT細(xì)胞克隆的建立及鑒定。 在本實驗中,我們首先探索了固相法擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇條件。其次,以~(60)Co照射的同種異體PBMC作為飼養(yǎng)細(xì)胞,以有限稀釋法對經(jīng)過陽性分選的γδT細(xì)胞進(jìn)行克隆化。用流式細(xì)胞術(shù)及分子生物學(xué)檢測鑒定所獲克隆,以MTT摻入法對所獲克隆進(jìn)行細(xì)胞毒檢測。結(jié)果共獲得五株γδT細(xì)胞克隆,這五株克隆均為Vγ9Vδ2亞型,CD4分子和CD8分子表達(dá)均為陰性,對腫瘤細(xì)胞SKOV3均具有一定的殺傷作用。在這5株γδT細(xì)胞克隆中,有兩株為單克隆,且這兩株單克隆經(jīng)證實為相同克隆,其VδCDR3區(qū)序列為ACDTIPGDLVRADKLIFGKG,VγCDR3區(qū)序列為ALWEVGKLGKKIKVFGPG。另三株克隆為寡克隆,其中有兩株為雙克隆,另一株為三克隆。這五株γδT細(xì)胞克隆的相關(guān)功能實驗正在進(jìn)行之中。 綜上,本實驗第二部分建立了正常人外周血γδT細(xì)胞克隆,為深入研究γδT細(xì)胞結(jié)構(gòu)、表面標(biāo)志、亞群及功能奠定了堅實的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1354100