本文關(guān)鍵詞：DNA脫甲基化對(duì)整合至rDNA區(qū)外源基因hFⅧ表達(dá)量的影響　出處：《中南大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： DNA甲基化作為一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制,在許多生物學(xué)過程中扮演著重要的角色,包括胚胎發(fā)育、遺傳印記、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等。pHrneo是被我室構(gòu)建的一種人類核糖體DNA打靶載體。它能靶向外源基因到人類核糖體DNA區(qū)。由pHrneo攜帶的外源基因能穩(wěn)定地在多種細(xì)胞中表達(dá),包括HL7702(人類肝細(xì)胞)和HT1080(人類纖維肉瘤細(xì)胞),但是,其表達(dá)效率有待于進(jìn)一步提高。影響定點(diǎn)整合目的基因表達(dá)的因素可能有多種,包括目的基因的拷貝數(shù)、DNA甲基化修飾、組蛋白的乙酰化修飾等。這里我們從DNA甲基化修飾的角度,探究其對(duì)定點(diǎn)整合目的基因表達(dá)的影響。 目的:通過比較脫甲基化藥物5-aza-2'-deoxycytidine處理組和對(duì)照組定點(diǎn)整合克隆細(xì)胞株目的基因人凝血因子Ⅷ的表達(dá)情況,以及目的基因CMV啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況,研究DNA甲基化對(duì)目的基因表達(dá)的影響。 方法:我們選擇三種不同濃度的脫甲基化藥物5-aza-2'-deoxycitidine-5μM、10μM、20μM,分別對(duì)pHrneoSK39-25細(xì)胞株處理72小時(shí)和120小時(shí),同時(shí)以未加脫甲基化藥物處理的定點(diǎn)整合克隆細(xì)胞株、脫甲基化藥物處理的HT1080細(xì)胞株和相同條件下未處理細(xì)胞的同濃度的脫甲基化藥物為對(duì)照組。收集各組細(xì)胞上清,通過ELISA檢測(cè)各組hFⅧ的表達(dá)情況。此外,用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR,確定CMV啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果:ELISA檢測(cè)各組目的基因表達(dá)情況顯示,用5-aza-2'-deoxycytidine處理72小時(shí)和120小時(shí)的細(xì)胞,hFⅧ的表達(dá)量分別是未加脫甲基化藥物處理對(duì)照組的5倍和10倍。重亞硫酸鹽測(cè)序PCR的結(jié)果顯示目的基因CMV啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)有甲基化位點(diǎn)。 結(jié)論:DNA甲基化修飾對(duì)定點(diǎn)整合目的基因的表達(dá)有較大影響,但是這種影響可能并非由目的基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化引起的。我們推測(cè)rDNA區(qū)脫甲基化引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化可能是造成這一結(jié)果的原因。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1352989