本文關(guān)鍵詞：單鏈脫氧寡核苷酸介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體基因點突變小鼠肝臟原位修復(fù)研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的 低密度脂蛋白受體(LDLR)基因突變可導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥(FH)。修飾的單鏈脫氧寡核苷酸(MSO)可在基因組的任意位點糾正突變的堿基。本文旨在用反義MSO(A-MSO)對小鼠在體肝細(xì)胞中的點突變的LDLR基因進(jìn)行原位修復(fù)研究。 方法 1 HepG2細(xì)胞LDLR基因無義突變模型原位修復(fù) 1.1構(gòu)建并鑒定LDLR-蟲螢光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表達(dá)載體 將野生型(WT)或660突變型(無義突變)LDLR基因連接到蟲螢光素酶基因(luc)5'端,構(gòu)建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一個C到A的點突變,導(dǎo)致一個無義突變和HinfI酶切位點。DNA測序鑒定質(zhì)粒。 1.2制備和鑒定HepG2細(xì)胞LDLR基因無義突變模型 將p660-LDLR-luc瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染后48h HepG2細(xì)胞裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)以鑒定無義突變模型。 1.3 MSO原位修復(fù)HepG2細(xì)胞LDLR基因無義突變 反義MSO(A-MSO)或正義MSO(S-MSO)可序列特異地置換堿基導(dǎo)致突變修復(fù)。A-MSO或S-MSO與p660-LDLR-luc共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后72h檢測HepG2細(xì)胞裂解液的FLA以驗證無義突變能否修復(fù),并篩選出較佳的MSO鏈。 2小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型原位修復(fù) 2.1驗證水動力法的肝靶向性 小鼠用水動力法轉(zhuǎn)染pwT-LDLR-luc,檢測肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA),以驗證水動力法的肝靶向性。 2.2制備和鑒定小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型 小鼠用水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc,檢測肝FLA和PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析以鑒定小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變模型。 2.3 MSO肝靶向原位修復(fù)小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因無義突變 小鼠水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc后12h,以多聚乙烯亞胺(PEI)為載體結(jié)合水動力法把MSO輸送到小鼠肝臟。給A-MSO 60h后,檢測小鼠肝組織裂解液的FLA,以判斷無義突變是否修復(fù)。 2.4 DNA水平驗證無義突變修復(fù) PCR-RFLP和DNA測序以驗證LDLR基因無義突變是否修復(fù)。 結(jié)果 1 HepG2細(xì)胞實驗 1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA測序結(jié)果 p660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一個C到A的突變(TGA),pWT-LDLR-luc則否。 1.2蟲螢光素酶在HepG2細(xì)胞中的表達(dá) 比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc低,但比對照組(轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-EGFP)高,差異顯著(p＜0.01)。這表明無義突變可能未完全終止蟲螢光素酶的表達(dá)。 1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2細(xì)胞中增強p660-LDLR-luc表達(dá)蟲螢光素酶 比較用p660-LDLR-luc和各種MSO共轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的FLA,結(jié)果顯示A-MSO和S-MSO均可明顯增強p660-LDLR-luc表達(dá)蟲螢光素酶,且A-MSO較S-MSO強,差異顯著(p＜0.01)。 2小鼠實驗 2.1目的質(zhì)粒靶向小鼠肝臟 小鼠水動力法轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-luc后72h,檢測小鼠肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示小鼠肝組織FLA較高,而肝外組織幾乎檢測不到FLA。這表明水動力法轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了目的質(zhì)粒的肝特異性轉(zhuǎn)染。 2.2蟲螢光素酶在小鼠肝細(xì)胞中的表達(dá)及PCR-RFLP結(jié)果 比較分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的小鼠在體肝組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc組低,但比對照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1)高,差異顯著(p＜0.01)。這表明無義突變在小鼠肝臟可能未完全終止蟲螢光素酶的表達(dá)。PCR-RFLP分析表明小鼠肝細(xì)胞中LDLR基因無義突變未被自動修復(fù)。 2.3 A-MSO在小鼠肝細(xì)胞中增強p660-LDLR-luc表達(dá)蟲螢光素酶 比較A-MSO組和C-MSO(對照MSO)組的FLA,結(jié)果表明A-MSO組的FLA明顯高于C-MSO組的FLA(p＜0.01)。 2.4突變堿基A被置換成堿基C PCR-RFLP分析和DNA測序進(jìn)一步表明LDLR基因上的堿基A被置換成C。 結(jié)論 小鼠水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc可用于制備小鼠在體肝細(xì)胞LDLR基因點突變模型。PEI結(jié)合水動力法可使A-MSO有效靶向肝臟。A-MSO可肝內(nèi)原位修復(fù)點突變的LDLR基因。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 王銀松,李英霞,宋妮,張華;靶向抗腫瘤藥物甲氨喋呤-琥珀酰殼聚糖綴合物的制備及其體外穩(wěn)定性的初步探討[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2003年11期

2 劉新宇,梁東春,張鏡宇;三種非病毒載體轉(zhuǎn)染方法的比較[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2003年04期

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本文編號：1352595