本文關鍵詞：單鏈脫氧寡核苷酸介導的低密度脂蛋白受體基因點突變小鼠肝臟原位修復研究　出處：《南京醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 家族性高膽固醇血癥 低密度脂蛋白受體基因 無義突變 單鏈脫氧寡核苷酸 基因治療

【摘要】： 目的 低密度脂蛋白受體(LDLR)基因突變可導致家族性高膽固醇血癥(FH)。修飾的單鏈脫氧寡核苷酸(MSO)可在基因組的任意位點糾正突變的堿基。本文旨在用反義MSO(A-MSO)對小鼠在體肝細胞中的點突變的LDLR基因進行原位修復研究。 方法 1 HepG2細胞LDLR基因無義突變模型原位修復 1.1構建并鑒定LDLR-蟲螢光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表達載體 將野生型(WT)或660突變型(無義突變)LDLR基因連接到蟲螢光素酶基因(luc)5'端,構建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一個C到A的點突變,導致一個無義突變和HinfI酶切位點。DNA測序鑒定質粒。 1.2制備和鑒定HepG2細胞LDLR基因無義突變模型 將p660-LDLR-luc瞬時轉染HepG2細胞,檢測轉染后48h HepG2細胞裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)以鑒定無義突變模型。 1.3 MSO原位修復HepG2細胞LDLR基因無義突變 反義MSO(A-MSO)或正義MSO(S-MSO)可序列特異地置換堿基導致突變修復。A-MSO或S-MSO與p660-LDLR-luc共轉染HepG2細胞,轉染后72h檢測HepG2細胞裂解液的FLA以驗證無義突變能否修復,并篩選出較佳的MSO鏈。 2小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型原位修復 2.1驗證水動力法的肝靶向性 小鼠用水動力法轉染pwT-LDLR-luc,檢測肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA),以驗證水動力法的肝靶向性。 2.2制備和鑒定小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型 小鼠用水動力法轉染p660-LDLR-luc,檢測肝FLA和PCR結合限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析以鑒定小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型。 2.3 MSO肝靶向原位修復小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變 小鼠水動力法轉染p660-LDLR-luc后12h,以多聚乙烯亞胺(PEI)為載體結合水動力法把MSO輸送到小鼠肝臟。給A-MSO 60h后,檢測小鼠肝組織裂解液的FLA,以判斷無義突變是否修復。 2.4 DNA水平驗證無義突變修復 PCR-RFLP和DNA測序以驗證LDLR基因無義突變是否修復。 結果 1 HepG2細胞實驗 1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA測序結果 p660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一個C到A的突變(TGA),pWT-LDLR-luc則否。 1.2蟲螢光素酶在HepG2細胞中的表達 比較轉染不同質粒的HepG2細胞裂解液的FLA。結果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc低,但比對照組(轉染pWT-LDLR-EGFP)高,差異顯著(p＜0.01)。這表明無義突變可能未完全終止蟲螢光素酶的表達。 1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2細胞中增強p660-LDLR-luc表達蟲螢光素酶 比較用p660-LDLR-luc和各種MSO共轉染的HepG2細胞的FLA,結果顯示A-MSO和S-MSO均可明顯增強p660-LDLR-luc表達蟲螢光素酶,且A-MSO較S-MSO強,差異顯著(p＜0.01)。 2小鼠實驗 2.1目的質粒靶向小鼠肝臟 小鼠水動力法轉染pWT-LDLR-luc后72h,檢測小鼠肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的FLA。結果顯示小鼠肝組織FLA較高,而肝外組織幾乎檢測不到FLA。這表明水動力法轉染導致了目的質粒的肝特異性轉染。 2.2蟲螢光素酶在小鼠肝細胞中的表達及PCR-RFLP結果 比較分別轉染不同質粒的小鼠在體肝組織裂解液的FLA。結果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc組低,但比對照組(轉染pEGFP-N1)高,差異顯著(p＜0.01)。這表明無義突變在小鼠肝臟可能未完全終止蟲螢光素酶的表達。PCR-RFLP分析表明小鼠肝細胞中LDLR基因無義突變未被自動修復。 2.3 A-MSO在小鼠肝細胞中增強p660-LDLR-luc表達蟲螢光素酶 比較A-MSO組和C-MSO(對照MSO)組的FLA,結果表明A-MSO組的FLA明顯高于C-MSO組的FLA(p＜0.01)。 2.4突變堿基A被置換成堿基C PCR-RFLP分析和DNA測序進一步表明LDLR基因上的堿基A被置換成C。 結論 小鼠水動力法轉染p660-LDLR-luc可用于制備小鼠在體肝細胞LDLR基因點突變模型。PEI結合水動力法可使A-MSO有效靶向肝臟。A-MSO可肝內原位修復點突變的LDLR基因。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 王銀松,李英霞,宋妮,張華;靶向抗腫瘤藥物甲氨喋呤-琥珀酰殼聚糖綴合物的制備及其體外穩(wěn)定性的初步探討[J];高等學�；瘜W學報;2003年11期

2 劉新宇,梁東春,張鏡宇;三種非病毒載體轉染方法的比較[J];天津醫(yī)科大學學報;2003年04期

，

本文編號：1352595