本文關(guān)鍵詞：與人遺傳病相關(guān)的DNA重復(fù)序列PCR條件優(yōu)化及遺傳不穩(wěn)定性的研究　出處：《內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來(lái),人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病與DNA重復(fù)序列擴(kuò)增或刪除有關(guān),這些疾病所涉及的重復(fù)序列的一個(gè)共同特點(diǎn)是以非孟德?tīng)栠z傳方式在世代間發(fā)生動(dòng)態(tài)突變,且往往伴隨著遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。 進(jìn)行與人類遺傳病相關(guān)的重復(fù)序列的遺傳不穩(wěn)定性的研究時(shí),應(yīng)用PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒內(nèi)含有的重復(fù)序列長(zhǎng)度是一個(gè)基本的實(shí)驗(yàn)方法。我們采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法,對(duì)與人神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的DNA重復(fù)序列PCR擴(kuò)增體系中的模板DNA濃度、Taq酶濃度、引物濃度、dNTP濃度等4種影響因素進(jìn)行了優(yōu)化篩選,發(fā)現(xiàn)引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響的顯著性最大。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了引物濃度單因素實(shí)驗(yàn),得到最優(yōu)DNA重復(fù)序列PCR擴(kuò)增體系在25μL反應(yīng)體系中各組分的最適濃度分別為:模板3 ng/μL、Taq酶0.75 U、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。通過(guò)優(yōu)化前后反應(yīng)體系的對(duì)比,擴(kuò)增目的產(chǎn)物的量有較大程度的提高。該優(yōu)化體系的建立為進(jìn)一步研究和人遺傳病相關(guān)的DNA重復(fù)序列的遺傳不穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。 在研究人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的遺傳不穩(wěn)定性及藥物作用的影響時(shí),需要制備成百上千的PCR樣品進(jìn)行定性檢測(cè)重復(fù)序列的長(zhǎng)度變化情況。為了探索含重復(fù)序列質(zhì)粒PCR模板的快速簡(jiǎn)易制備方法,本文分別利用高速離心法、TE煮沸法和TE/SDS煮沸法處理過(guò)夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒大腸桿菌菌體,制備模板后進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn),均能得到比較清晰的目的條帶,可以用于含重復(fù)序列質(zhì)粒的初步鑒定。相比較而言,高速離心5min、TE煮沸3min、TE/SDS煮沸2.5min制備的樣品PCR擴(kuò)增后效果較好。這三種方法快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、無(wú)污染,簡(jiǎn)化了PCR模板制備的過(guò)程,為藥物處理后重復(fù)序列長(zhǎng)度大量鑒定的研究奠定了基礎(chǔ)。 多核苷酸的重復(fù)只有超過(guò)一定的閾值時(shí)才可能導(dǎo)致遺傳病的發(fā)生,如果能夠控制重復(fù)次數(shù)從而抑制其擴(kuò)增或運(yùn)用一種方法使擴(kuò)增的重復(fù)序列刪除縮短,對(duì)于由DNA重復(fù)序列引起的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的治療及預(yù)防具有非常重要的意義。我們利用絲裂霉素C和甲基磺酸乙酯兩種化學(xué)藥物,在10%的菌體存活率下,連續(xù)多次處理含重復(fù)序列(GAA)42、(ATTCT)43的重組質(zhì)粒的大腸桿菌后,經(jīng)檢測(cè)其長(zhǎng)度變化發(fā)現(xiàn),兩種化學(xué)藥物在不同程度上都可以促使重復(fù)序列發(fā)生刪除。絲裂霉素C處理9次、甲基磺酸乙酯處理13次后(GAA)42的刪除率分別達(dá)到86.7%、43.3%,且刪除后長(zhǎng)度多數(shù)處于體內(nèi)的正常范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,化學(xué)藥物可能促進(jìn)與人遺傳病相關(guān)的DNA重復(fù)序列的長(zhǎng)片段發(fā)生刪除,為研究該類疾病的致病機(jī)理及治療方案奠定了一定的基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years, it has been found that more than 40 kinds of human nervous system disease and DNA repeat amplification or deletion, a common feature of repetitive sequences of these diseases involved is in non Mendel genetic mode among generations dynamic mutation, and is often accompanied by the phenomenon of genetic anticipation.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R394

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1347280