本文關(guān)鍵詞：大鼠抗人RANTES單克隆抗體在減輕大鼠小腸移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用及其人源化　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 趨化因子 RANTES 大鼠 單克隆抗體 小腸移植 人源化

【摘要】： 目的： 1.制備大鼠抗人RANTES分子單克隆抗體(mAb)，并進(jìn)行初步鑒定，為研究RANTES分子的組織分布和功能提供實(shí)驗(yàn)手段。 2.掌握三袖套血管吻合法大鼠節(jié)段性異位小腸移植動(dòng)物模型及靜脈營養(yǎng)支持模型的建立方法。 3.將制備的大鼠抗人RANTES單克隆抗體應(yīng)用于大鼠小腸移植模型,驗(yàn)證其在減輕移植排斥中的作用。 4.對(duì)大鼠抗人RNATES單克隆抗體進(jìn)行初步的人源化改造。 方法： 1.應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備大鼠源性抗人RANTES mAb。ELISA鑒定腹水效價(jià)；用Western blot鑒定mAb活性；用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行鑒定。 2.選用近交系成年雄性SD和Wistar大鼠進(jìn)行節(jié)段性異位小腸移植,采用三袖套血管吻合法。實(shí)驗(yàn)分4組，第1組：非手術(shù)對(duì)照組（SD）；第2組，同基因移植對(duì)照組（SD→SD）；第3組：異基因移植未治療組(SD→Wistar)；第4組，大鼠抗人RANTES mAb治療組[SD→Wistar +mAb（3mg·kg-1·d-1，ip）]。移植術(shù)后3，5，7天分別取各組大鼠移植腸標(biāo)本（n=6）進(jìn)行HE染色，觀察大體情況及組織病理學(xué)變化。 3.應(yīng)用ELISA試劑盒對(duì)術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-2,IL-6,TNF- 及RANTES濃度進(jìn)行檢測,并用免疫組化法檢測受體大鼠小腸組織內(nèi)RNATES濃度。 4.利用RT-PCR技術(shù)，從雜交瘤細(xì)胞株中擴(kuò)增單克隆抗體VH及VL基因，并連接到人源化表達(dá)載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，純化表達(dá)上清中蛋白分子。 結(jié)果： 1.獲得2株分泌抗RANTES mAb的雜交瘤細(xì)胞株。間接ELISA測定腹水效價(jià)均達(dá)10-6，一株mAb為IgG1亞類，另一株為IgM；Western blot結(jié)果顯示兩株mAb與人RANTES均有良好的結(jié)合活性。在免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用中獲得較滿意效果。 2.異基因移植未治療組大鼠移植腸組織病理學(xué)檢查顯示移植后第3，5，，7天分別出現(xiàn)輕、中、重度排斥反應(yīng)。同基因移植組和單克隆抗體治療組均未見明顯排斥反應(yīng)征象。 3.ELISA試劑盒測試結(jié)果顯示單克隆抗體治療組與未治療組相比,大鼠血清中IL-2,IL-6,TNF- 及RANTES濃度均明顯減低。而小腸組織中RANTES濃度也明顯減低。 4.得到2株表達(dá)人源化抗體的細(xì)胞株,并獲得純化蛋白。結(jié)論： 1.制備了兩株大鼠抗人RANTES單克隆抗體，這2株單克隆抗體均能應(yīng)用于Western blot、流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)；而只有No.1抗體株能應(yīng)用于免疫組織化學(xué)技術(shù)。 2.將大鼠抗人RANTES單克隆抗體應(yīng)用于大鼠小腸移植模型，發(fā)現(xiàn)其可減輕術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。 3.改進(jìn)了大鼠小腸移植模型的制作方法，建立受體大鼠靜脈營養(yǎng)支持模型。 4.利用嵌合抗體技術(shù)對(duì)大鼠抗人RNATES單克隆抗體進(jìn)行了初步的人源化改造，為進(jìn)一步表達(dá)及應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective:
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1346966