本文關(guān)鍵詞：TLR4和核仁素受體介導(dǎo)呼吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元的初步研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)為副粘病毒科肺炎病毒屬,是有包膜非節(jié)段性的單股負鏈RNA病毒,同時也是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的最主要病原,在嬰幼兒中發(fā)病率和死亡率較高。然而RSV也可感染神經(jīng)系統(tǒng),引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,如嗜睡、抽搐、驚厥、癲癇等,目前已有多項關(guān)于RSV誘發(fā)腦病的臨床病例報道,但RSV感染神經(jīng)系統(tǒng)的機制目前尚不明確,有待進一步研究。中樞神經(jīng)元細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的功能細胞,它的異�？赡苤苯訉�(dǎo)致腦病癥狀的發(fā)生。已有文獻表明神經(jīng)元細胞上同時表達TLR4,目前已知小鼠神經(jīng)元細胞膜上表達TLR4受體,小鼠小膠質(zhì)細胞膜上表達核仁素,而小鼠神經(jīng)元上是否表達核仁素受體目前尚未見報道,有待確認,并且這兩種受體可以同時識別RSV F蛋白,因此我們設(shè)想RSV可能通過這兩種受體的介導(dǎo)作用而直接感染神經(jīng)元,引起神經(jīng)元損傷病變。TLR3和TLR7是與RSV感染密切相關(guān)的受體,其中TLR7可以識別RSV的單鏈RNA, TLR3可識別RSV復(fù)制過程中所產(chǎn)生的雙鏈RNA,有文獻報道稱TLR3的激活可對神經(jīng)元起保護作用。本實驗室前期實驗證明,在RSV體外感染A549細胞及體內(nèi)感染BALB/c小鼠后,TLR3/TLR7表達量都呈上升趨勢,本文通過檢測神經(jīng)元細胞TLR3/TLR7表達量的變化以揭示病毒感染神經(jīng)元后細胞活化情況。本課題擬用RSV體外直接接種中樞神經(jīng)元,激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測病毒與受體結(jié)合情況,western blot技術(shù)檢測TLR4、核仁素表達情況,并檢測病毒感染后TLR3、TLR7活化及細胞損傷情況等,初步探討TLR4與C23介導(dǎo)RSV感染神經(jīng)元及損傷的相關(guān)機制。 目的：通過RSV接種中樞神經(jīng)元,觀察細胞內(nèi)病毒所在位置及神經(jīng)元病變損傷,探討RSV能否感染神經(jīng)元；通過檢測RSV感染神經(jīng)元后RSVF蛋白與受體TLR4、C23結(jié)合情況及細胞膜上TLR4和C23受體蛋白表達量變化,以及細胞內(nèi)TLR3、TLR7受體蛋白的活化,細胞凋亡損傷情況等,初步研究TLR4和C23受體在RSV感染及損傷神經(jīng)元過程中所起的作用,為臨床嬰幼兒RSV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機理研究、治療和預(yù)防等提供新的思路。 方法：(1)用RSV直接接種體外培養(yǎng)的中樞神經(jīng)元N2a細胞,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞病變情況,并用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化,然后用透射電鏡分別在不同的時間點觀察RSV感染能否進入N2a細胞,病毒在細胞的位置。(2)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察RSV感染N2a細胞后細胞形態(tài)變化,病毒F蛋白與TLR4和核仁素受體結(jié)合情況。(3)免疫印跡法(Western-blot)檢測RSV感染N2a細胞不同時間點細胞膜受體TLR4、C23及細胞內(nèi)受體TLR3、TLR7蛋白水平的變化,以未感染的細胞作為對照組。(4)流式細胞術(shù)檢測RSV感染N2a細胞不同時間點細胞的凋亡病變情況。 結(jié)果：(1)透射電鏡結(jié)果顯示,RSV感染N2a1h, N2a細胞膜邊緣可見RSV病毒顆粒；RSV感染N2a2h和4h胞內(nèi)可見RSV病毒顆粒；感染12h和24h細胞內(nèi)病毒顆粒增加；感染2d在細胞內(nèi)可見病毒包涵體；感染4d病毒量進一步增加,并且細胞形態(tài)發(fā)生變化。 (2)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)結(jié)果顯示,RSV感染N2a細胞1h,F蛋白與TLR4及核仁素受體都有結(jié)合,但與TLR4結(jié)合更多。RSV感染N2a細胞4d,可見細胞核形態(tài)發(fā)生變化。 (3) western blot測定結(jié)果顯示,正常組中TLR4/C23、TLR3/TLR7蛋白水平表達量較低,而在RSV感染組,隨著感染時間增加,TLR3/TLR7表達不斷上調(diào)。TLR4/C23在RSV感染1h、2h和4h表達量逐漸增高,4h后表達量降低,到感染第4天,下降到與正常水平相接近。 (4)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,RSV感染N2a細胞0h、1h、2h、4h、12h和24h,細胞均無早期凋亡及晚期凋亡變化,感染2d后可見細胞早期凋亡比例超過30%,感染3d和4d,早期凋亡比例和晚期凋亡比例均超過30%,有統(tǒng)計學(xué)意義,并且在感染的第2d-4d,隨著感染時間點的延長,早期凋亡比例呈降低趨勢,晚期凋亡比例呈上升趨勢。 結(jié)論：RSV可直接感染中樞神經(jīng)元N2a細胞,引起病變,同時可引起細胞膜受體TLR4和C23及細胞內(nèi)受體TLR3和TLR7蛋白表達量的變化,并且認為RSV可通過與N2a細胞膜上的TLR4和C23受體結(jié)合從而進入并感染N2a細胞,其中以TLR4的結(jié)合為主。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 胡旭;嬰幼兒重癥肺炎合并中毒性腦病的治療分析[J];安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2005年03期

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本文編號：1336652