本文關(guān)鍵詞：b型流感嗜血桿菌多糖制備工藝優(yōu)化及其與D蛋白結(jié)合的研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b, Hib)結(jié)合疫苗可以保護(hù)5歲以下嬰幼兒免受Hib細(xì)菌引起的多種侵襲性疾病感染�，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)上市的結(jié)合疫苗是以破傷風(fēng)類毒素為載體,但其具有的局限性如產(chǎn)生的免疫抑制和毒性回復(fù)現(xiàn)象,因此尋找安全有效的新型載體成為結(jié)合疫苗研究的新方向。在國(guó)外上市的流感嗜血桿菌D蛋白作為疫苗載體已應(yīng)用于十價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合苗中,其安全性和免疫性均較好。目前,國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有以D蛋白為載體的Hib結(jié)合疫苗的報(bào)道。 第一部分：b型流感嗜血桿菌多糖及D蛋白載體制備工藝的研究 應(yīng)用陽(yáng)離子表面活性劑CTAB沉淀陰離子多聚物時(shí),發(fā)酵液上清的pH對(duì)Hib莢膜多糖的產(chǎn)量有重要影響。三批發(fā)酵液上清樣品分別調(diào)節(jié)pH至12個(gè)不同水平(5.25-8.0),純化過(guò)程按照Gotschlich等人的純化步驟進(jìn)行。Hib莢膜多糖溶解pH分別調(diào)至5.25、7.0、8.0并進(jìn)行1HNMR分析。當(dāng)發(fā)酵液上清pH為6.5時(shí),Hib精糖的回收率較高,且其結(jié)構(gòu)與要求保持一致。對(duì)三批制備的莢膜多糖的粗糖和精糖重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其結(jié)果即p0.01(粗糖：0.001,0.001及0.001；精糖：0.002,0.01及0.001)。故研究表明發(fā)酵液上清pH對(duì)Hib精糖的產(chǎn)量有顯著影響。 本文通過(guò)對(duì)Hib D蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增,去除信號(hào)肽的hpd基因片段插入pET43.1a表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化如大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),D蛋白可溶性表達(dá)。該蛋白經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀,經(jīng)DEAE sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化得到高純度的重組D蛋白后,通過(guò)Western blot的方法證明免疫反應(yīng)性較好。 第二部分：Hib多糖與D蛋白結(jié)合疫苗的制備 采用CDAP法在不同pH條件下活化Hib莢膜多糖,再通過(guò)乙二酰肼(ADH)與D蛋白共價(jià)結(jié)合,制備Hib莢膜多糖與其D蛋白結(jié)合物原液,并對(duì)三批結(jié)合物原液的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合物原液經(jīng)Sepharose4FF凝膠層析柱純化出多糖蛋白結(jié)合物。對(duì)三批結(jié)合物原液的多糖、蛋白、高分子結(jié)合物、分子量、EDAC殘余含量、免疫原性、無(wú)菌檢查和內(nèi)毒素等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。獲得的結(jié)合物原液免疫BALB/c小鼠,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清中的IgG抗體水平,評(píng)價(jià)其免疫原性。三批結(jié)合物原液以上檢測(cè)指標(biāo)均符合藥典要求。衍生物中ADH含量對(duì)結(jié)合物的免疫原性有重要影響。用CDAP活化工藝制備的Hib莢膜多糖-D蛋白結(jié)合物適宜制備結(jié)合疫苗。為以D蛋白為載體的Hib結(jié)合疫苗的制備及五價(jià)聯(lián)苗的研制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1323148