本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒潛伏感染下細(xì)胞的自噬現(xiàn)象　出處：《浙江大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)在人群中普遍感染,盡管HCMV在健康個體中的感染通常是無癥狀性感染,但對于存在免疫缺陷的個體,HCMV是導(dǎo)致其患病和死亡的主要原因。HCMV也是目前公認(rèn)的引起先天性感染最常見病原體,常導(dǎo)致新生兒畸形的發(fā)生。細(xì)胞自噬(autophagy)是一種主要由溶酶體介導(dǎo)的降解通路,作為細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)性機(jī)制,不僅可以通過將長壽命蛋白和衰老細(xì)胞器降解為小肽或氨基酸為細(xì)胞提供再生資源,而且也可作為宿主防御機(jī)制抵抗病原微生物的感染和寄生。近年對HCMV與自噬關(guān)系的研究也取得重要進(jìn)展,但現(xiàn)有關(guān)于HCMV和自噬之間關(guān)系的研究都是在HCMV增殖感染的細(xì)胞上進(jìn)行的,對于HCMV潛伏感染這種人群中更為普遍的感染模式,目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道其對自噬的影響。明確HCMV潛伏感染時對細(xì)胞自噬的影響,這將有助于闡明HCMV潛伏感染的發(fā)病機(jī)制,同時為HCMV防治藥物和疫苗的研發(fā)提供新靶標(biāo)。 方法 本研究主要包括兩部分：1)人巨細(xì)胞病毒潛伏感染模型的建立：以HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞(Human Embryo Lung Fibroblast,HEF)作為HCMV增殖感染對照組,以未感染的人急性單核白血病細(xì)胞(human acute monocytic leukaemia cellline,THP-1)作為空白對照組,用HCMV Towne株分別感染THP-1細(xì)胞和HEF細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；在感染后6h、5d、7d時去培養(yǎng)上清,收集細(xì)胞,用DNA抽提試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總DNA,熒光定量PCR檢測THP-1細(xì)胞內(nèi)HCMV的DNA拷貝數(shù)；Trizol法提取細(xì)胞總RNA, RT-PCR檢測HCMVIE1、IE2和UL81-82ast基因的表達(dá)水平；用RIPA強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,western-blot檢測HCMVIE蛋白水平。構(gòu)建穩(wěn)定的HCMV潛伏感染模型。 2)人巨細(xì)胞病毒潛伏感染下細(xì)胞的自噬現(xiàn)象： 透射電鏡下觀察HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞后能否在超微結(jié)構(gòu)水平誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn),并與空白組進(jìn)行對比；RT-PCR法定量分析HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄水平；western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和Atg5的表達(dá)水平,并和未感染HCMV Towne株的空白組進(jìn)行對比分析。 結(jié)果 成功構(gòu)建HCMV潛伏感染模型。熒光定量PCR結(jié)果顯示：每個THP-1細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù)大約在1.5個,在感染后1-5d逐漸增加,5d后逐漸減少；RT-PCR結(jié)果顯示:HEF細(xì)胞和THP-1細(xì)胞感染HCMV Towne株后均有HCMV即刻早期基因IE和潛伏相關(guān)基因UL81-82astmRNA的表達(dá)。HCMV Towne株感染的THP-1細(xì)胞,IE2基因mRNA在感染后6h、5d均有表達(dá),7d后基本不表達(dá)；IE1基因mRNA表達(dá)一直不明顯；UL81-82ast基因1nRNA在感染后6h即有表達(dá),并且一直持續(xù)到感染后7d。Western-blot結(jié)果顯示：在HCMV感染的HEF細(xì)胞,HCMV IE蛋白在感染后6h即有表達(dá),感染后5d、7d表達(dá)增加。在THP-1細(xì)胞,IE蛋白在感染后6h、5d有表達(dá),感染后7d時IE不表達(dá)。 HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞的自噬,和空白組THP-1細(xì)胞相比,電鏡結(jié)果顯示：Towne株感染THP-1細(xì)胞后,與空白組相比,病毒感染后1d就能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬體。在感染后5d,細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量自噬體和自噬溶酶體,局部也能見到池狀彎曲的雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬前體,以自噬溶酶體居多。感染后9d,細(xì)胞內(nèi)仍可見自噬體和自噬溶酶體的存在,但仍以自噬溶酶體為主。相比較之下,空白組細(xì)胞漿內(nèi)幾乎沒有自噬相關(guān)囊泡的出現(xiàn)。電子顯微鏡下,隨機(jī)選取10個空白組細(xì)胞和感染后1d、5d、9d的感染組細(xì)胞各10個,在不同的非連續(xù)性區(qū)域計數(shù)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)囊泡的數(shù)量：空白組細(xì)胞約2-3個自噬體或自噬溶酶體；感染后1d的細(xì)胞約10-13個；感染后5d的細(xì)胞約80個；感染后9d的細(xì)胞約30個。與空白組相比,自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在HCMV感染后明顯增加。促進(jìn)自噬的強(qiáng)度也存在變化：HCMV感染THP-1細(xì)胞5天后,在THP-1細(xì)胞上能建立穩(wěn)定的潛伏感染,在潛伏感染期間,HCMV促進(jìn)細(xì)胞自噬的強(qiáng)度較未建立潛伏感染之前減弱,表現(xiàn)為自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在潛伏期間逐漸減少,但和空白組細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平仍高。 結(jié)論 1、成功構(gòu)建了HCMV Towne株在THP-1細(xì)胞上穩(wěn)定的潛伏感染模型； 2、HCMV感染促進(jìn)THP-1細(xì)胞的自噬,但是在建立潛伏感染后,促進(jìn)細(xì)胞自噬強(qiáng)度較未建立潛伏感染時減弱。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1320095