本文關(guān)鍵詞：非接觸共培養(yǎng)條件下兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分密度梯度離心和貼壁篩選法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 目的探討兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）分離培養(yǎng)、鑒定和擴(kuò)增的方法，同時(shí)觀察BMSCs的生長(zhǎng)特性。方法應(yīng)用密度梯度離心和貼壁篩選法相結(jié)合分離純化BMSCs并在體外擴(kuò)增，利用倒置顯微鏡對(duì)各代BMSCs的生長(zhǎng)情況及形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)BMSCs的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制BMSCs的生長(zhǎng)曲線圖。對(duì)BMSCs行HE染色后觀察其形態(tài)學(xué)特征，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD34和CD44的表達(dá)，進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果在體外成功的實(shí)現(xiàn)了兔BMSCs的培養(yǎng)與增殖。觀察發(fā)現(xiàn)前3代的BMSCs增殖速度較快，生長(zhǎng)旺盛，隨著BMSCs的不斷傳代增殖活力逐漸降低。分離培養(yǎng)的BMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD29，CD44，陰性表達(dá)CD34。結(jié)論體外應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，可獲得高純度的BMSCs，培養(yǎng)的BMSCs呈纖維狀、克隆樣生長(zhǎng)，第1-3代細(xì)胞活性較強(qiáng)，可作為組織工程的種子細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分不同代次兔髓核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)性狀 目的研究兔不同代次髓核細(xì)胞的生物學(xué)特性，旨在找出合適的種子細(xì)胞去治療椎間盤退變性疾病。方法從新西蘭大耳白兔椎間盤髓核組織中，分離并培養(yǎng)髓核細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)傳代，對(duì)原代及第3，4代髓核細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；甲苯胺藍(lán)染色和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)髓核細(xì)胞內(nèi)聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)；反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)水平，觀察各代髓核細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。結(jié)果兔椎間盤髓核細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)并進(jìn)行傳代，，原代髓核細(xì)胞一般需7d左右貼壁，形狀呈類圓形或多角形，前3代髓核細(xì)胞都呈圓形或多角形，活力較強(qiáng)，HE染色后細(xì)胞核被染成均一藍(lán)黑色，胞漿呈現(xiàn)淡粉色；髓核細(xì)胞經(jīng)過(guò)甲苯胺藍(lán)染色后，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)天藍(lán)色，通過(guò)Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，胞漿內(nèi)表現(xiàn)為黃褐色沉淀。到第4代細(xì)胞出現(xiàn)退變，Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)水平較前幾代細(xì)胞顯著下降。結(jié)論前三代的髓核細(xì)胞代謝旺盛，表型一致，聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)正常，傳第4代后髓核細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老、退變。 第三部分非接觸共培養(yǎng)條件下兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化的潛能，為椎間盤退變性疾病的生物學(xué)治療提供大量的細(xì)胞來(lái)源。方法提取兔BMSCs，進(jìn)行培養(yǎng)傳代至第3代，提取培養(yǎng)兔NPCs，將第3代BMSCs與NPCs按培養(yǎng)要求分為三組，BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組，NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組，BMSCs與NPCs共培養(yǎng)組，應(yīng)用Transwell6孔培養(yǎng)板將BMSCs與NPCs進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的變化，在培養(yǎng)7天后利用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR及Western-blot技術(shù)分別對(duì)BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組中BMSCs和NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組中NPCs的Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，最后對(duì)各組細(xì)胞測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果成功分離提取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖在共培養(yǎng)組中BMSCs的表達(dá)與NPCs單獨(dú)培養(yǎng)組中NPCs的表達(dá)相近，較BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組中BMSCs的表達(dá)顯著增加。結(jié)論兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛能，在BMSCs與NPCs共培養(yǎng)的條件下BMSCs可轉(zhuǎn)化成為NPCs，BMSCs可能為椎間盤退變性疾病的生物學(xué)治療提供足夠的細(xì)胞來(lái)源。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1309380